副豬嗜血桿菌耐藥性分子機制研究.pdf

1、副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis，HPS)是豬上呼吸道的一種常在菌或條件致病菌，1910年K.Glasser首先發(fā)現(xiàn)并報道該病原，該菌感染豬后可引發(fā)多發(fā)性漿膜炎、關節(jié)炎和腦膜炎。近年來，由副豬嗜血桿菌所引起的革拉瑟氏病已成為影響?zhàn)B豬業(yè)發(fā)展的一種重要細菌性疾病。發(fā)病后及時采用抗生素進行治療可顯著降低動物死亡率，同時在生產(chǎn)過程中適當添加抗生素也可在一定程度上降低該病的發(fā)生率。但隨著大量抗菌藥特別是廣譜抗菌藥在養(yǎng)豬業(yè)中的

2、廣泛使用，細菌對抗菌藥物的耐藥性問題日趨突出，與此同時也有研究資料表明亞抑制濃度的抗生素可以影響細菌的代謝過程而改變細菌的毒力或細菌對環(huán)境的適應能力等。
　　 本研究圍繞副豬嗜血桿菌對喹諾酮類藥物的耐藥機理、耐藥質粒的分布情況及其與亞抑制濃度氟苯尼考相互作用進行研究，以了解副豬嗜血桿菌耐藥情況、耐藥機理及亞抑制濃度氟苯尼考對其轉錄譜的影響，為合理使用抗菌藥物提供理論基礎，主要研究內容、方法及結果如下：
　　 1.副豬嗜血

3、桿菌耐喹諾酮類藥物的機制研究
　　 副豬嗜血桿菌血清型眾多，免疫預防往往因為疫苗交叉保護力低而致免疫失敗，抗生素治療便成為控制革拉瑟氏病的主要手段和措施。氟喹諾酮類藥物因具有抗菌譜廣、殺菌力強等優(yōu)點而在養(yǎng)豬生產(chǎn)過程中得到廣泛應用。研究表明細菌對喹諾酮類藥產(chǎn)生耐藥性主要通過編碼旋轉酶和拓撲異構酶的基因gyrA和parC發(fā)生突變而引起，同時也存在由質粒qnr及外排泵所介導的耐藥。目前國外已圍繞副豬嗜血桿菌的藥物敏感性及耐藥性等問題進

4、行了大量研究，但國內的相關研究相對較少。
　　 本研究首先采用特異性16S rRNA PCR方法對臨床分離株進行鑒定，確認分離株是副豬嗜血桿菌后測定菌株對萘啶酸、環(huán)丙沙星和恩諾沙星的敏感性，然后用特異性PCR擴增副豬嗜血桿菌標準菌株和MIC值較高的臨床分離株的gyrA和parC基因的喹諾酮耐藥決定區(qū)(QRDR)并進行測序。采用Blast法對測序結果進行分析，包括副豬嗜血桿菌標準血清型間的比對及耐藥株與敏感株之間的比對。在測MIC

5、的同時添加外排泵抑制劑苯丙氨酸-精氨酸-β-萘酰胺以檢測是否存在由外排泵介導的細菌對喹諾酮類藥物的耐藥性，同時還設計特異性引物以擴增質粒qnr以檢測是否存在由質粒所介導的細菌對喹諾酮類藥物的耐藥性。
　　 研究結果表明，副豬嗜血桿菌標準血清型的QRDR序列間具有高度的保守性，未發(fā)現(xiàn)有差異基因。而耐藥株的gyrA和parC的QRDR區(qū)域存在數(shù)量不等、位置各異的突變位點，其中GyrA以83位和87位的突變?yōu)橹鳎l(fā)生突變的主要方式為s

6、er-83-phe和ser-83-tyr，asp-87-asn、asp-87-gly和asp-87-tyr。而ParC以73位和77位為主；GyrA的突變在副豬嗜血桿菌耐喹諾酮類藥物的機理中占主導作用，而ParC的突變僅起次要作用，往往發(fā)生于GyrA突變之后。在所用的臨床分離株中未發(fā)現(xiàn)由質粒和外排泵所介導的細菌對喹諾酮類藥物的耐藥性。研究結果可以為制定副豬嗜血桿菌對喹諾酮類藥物的敏感性判定標準提供理論依據(jù)。
　　 2.副豬嗜血桿

7、菌耐藥質粒的提取及功能分析
　　 常見的耐藥因子達數(shù)百種之多，其中部分耐藥因子可通過染色體突變產(chǎn)生并可以垂直傳播，部分耐藥因子由質粒等可移動元件所介導，能夠水平傳播。目前CLSI尚未確定各種抗菌藥物對副豬嗜血桿菌耐藥性的判定標準，因此不能僅僅依據(jù)各種藥物對副豬嗜血桿菌的MIC值大小確定菌株是否耐藥，若直接用PCR等方法去檢測耐藥因子則效率較低。本研究通過從副豬嗜血桿菌臨床分離株提取耐藥質粒，以了解副豬嗜血桿菌臨床分離株耐藥質粒的

8、流行情況及可能的耐藥情況。
　　 本研究用Qiagen公司質粒小提試劑盒對156株副豬嗜血桿菌臨床分離株進行質粒提取，所獲得的質粒先用合適的內切酶進行酶切，再與相應的載體連接后轉化感受態(tài)細胞，挑陽性重組子進行測序、注釋，進而獲得質粒分離菌株的耐藥情況。
　　 本研究僅在1株臨床分離株(A67)中分離出質粒，其大小約為4.2kb。內切酶Sau3AI可以將所分離出的質粒進行有效切割，獲得大小分別為2.7kb和1.5kb的片段

9、，將小片段與經(jīng)內切酶BamHI進行酶切后的pUC19載體進行連接，連接產(chǎn)物成功轉化BL21感受態(tài)細胞，挑選陽性重組子送上海生工生物有限公司用M13正、反向引物對插入序列進行測序。再根據(jù)所測得的小片段的堿基序列設計引物，以所提質粒為模板進行測序，直至測通。用DNAstar軟件對測序所獲得的序列進行拼接并刪除重復序列，得到一閉合環(huán)狀的質粒DNA，其大小為4248bp，其中主要包含有mobA、mobB和mobC等移動因子和sul2及strA兩

10、種耐藥因子，質粒序列已保存至GenBank(No.FJ670543)。
　　 對含有耐藥質粒的菌株進行了鏈霉素和磺胺甲基異惡唑的藥物敏感性試驗，其MIC值大小分別為128和512μg/mL。所提取的質?？梢猿晒D化至多殺性巴氏桿菌，轉化菌對上述兩種藥物也產(chǎn)生耐藥性。研究結果表明，該質?？梢越閷Ц必i嗜血桿菌對鏈霉素和磺胺類藥物產(chǎn)生耐藥性。
　　 3.亞抑制濃度氟苯尼考對副豬嗜血桿菌轉錄譜的影響研究
　　 不同濃度的

11、抗生素對細菌會產(chǎn)生不同的作用，高濃度抗生素對細菌產(chǎn)生抑制或殺滅作用，而低濃度抗生素不但不能抑制或殺滅細菌，而且有可能作為一種信號物質對細菌的代謝過程進行調節(jié)，進而影響細菌的毒力和適應性等特性。
　　 本研究選用我國養(yǎng)豬生產(chǎn)中廣泛使用的廣譜抗生素——氟苯尼考作為研究對象，探討亞抑制濃度氟苯尼考對副豬嗜血桿菌轉錄譜的影響。根據(jù)GenBank所公布的副豬嗜血桿菌SH0165株全序列(CP001321)設計探針，由Agilent公司進行

12、芯片的設計與制作。
　　 將副豬嗜血桿菌臨床分離株SH0165株分別于添加亞抑制濃度氟苯尼考(0.25μg/mL)和不添加藥物的條件下培養(yǎng)16h，分別提取mRNA用于后續(xù)的芯片研究，每個處理組設3個生物學重復。以mRNA進行反轉錄獲得cDNA及cRNA，并對cRNA進行熒光標記，點校進行檢測而獲得差異表達基因，用實時熒光定量PCR對差異表達基因進行驗證。
　　 經(jīng)亞抑制濃度氟苯尼考作用后，副豬嗜血桿菌的轉錄譜較對照組發(fā)生

13、較明顯的改變，共有163個基因表達水平變化在1.5倍(p＜0.05)以上，其中96個基因表達上調，另外67個基因表達下調。表達上調的基因主要包括參與碳水化合物代謝、鐵離子攝取與利用、潛在毒力因子神經(jīng)氨酸酶等，這些基因的表達上調可以增強細菌對環(huán)境的適應能力，同時也可能改變菌株的潛在毒力。而作為主要抑制蛋白質合成的抗生素，亞抑制濃度氟苯尼考對蛋白質合成的相關基因的抑制作用卻很輕微。
　　 本研究結果表明，臨床上使用低劑量抗生素預防呼