水稻條紋病毒mRNA轉(zhuǎn)錄起始機(jī)制及其NSvc2蛋白在植物細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位研究.pdf

1、水稻條紋病毒（Rice stripe virus，RSV）作為纖細(xì)病毒屬的典型成員，是引起水稻條紋葉枯病的病原物，在灰飛虱體內(nèi)循回并增殖，以持久方式經(jīng)卵傳播，在我國(guó)廣大稻區(qū)已經(jīng)造成了極其嚴(yán)重的危害。通過(guò)幾十年的努力，研究者在RSV的很多方面取得了巨大的成果，如基因組結(jié)構(gòu)及其編碼策略和蛋白功能、病毒粒子形態(tài)、抗病育種等，但還有很多方面值得更深入地認(rèn)識(shí)和研究。RSV是一個(gè)負(fù)義鏈RNA病毒，其RNA5'端并不存在帽子結(jié)構(gòu)，而其mRNA5'末端

2、卻有一段非病毒來(lái)源的RNA序列，那么這些短的、非病毒的帽子結(jié)構(gòu)的來(lái)自什么地方，又有什么規(guī)律可尋呢？另一個(gè)值得關(guān)注的問(wèn)題是RSV病毒粒子形態(tài)，RSV與布尼亞病毒科病毒的親緣關(guān)系十分近，但二者的病毒粒子形態(tài)卻差別非常大，這是又是什么原因造成的呢？為了解答這兩個(gè)疑惑，本研究開展了以下兩方面的研究:
　　1.水稻條紋病毒mRNA轉(zhuǎn)錄起始機(jī)制的研究
　　RNA帽子結(jié)構(gòu)存在于所有真核生物mRNA和大多數(shù)病毒基因組RNA的5'端，它對(duì)于R

3、NA的有效剪切、RNA出核轉(zhuǎn)運(yùn)和RNA自身穩(wěn)定具有重要的作用。但是分段負(fù)義鏈RNA病毒的RNA5'端不存在帽子結(jié)構(gòu)，而其mRNA5'末端卻有一段非病毒來(lái)源的RNA序列，RSV mRNA5'端同樣存在這樣的序列，RSV是否和其他負(fù)義鏈RNA病毒一樣通過(guò)“抓帽”機(jī)制獲得這些帽子結(jié)構(gòu)。
　　為了探明RSVmRNA5'端這些短的、非病毒的帽子結(jié)構(gòu)的來(lái)源機(jī)制，本研究將RSV和具5'端帽子結(jié)構(gòu)的正義鏈RNA病毒黃瓜花葉病毒(Cucumber

4、mosaic virus，CMV)共侵染本氏煙，結(jié)果發(fā)現(xiàn)前者可“竊取”后者RNA5'端的帽子結(jié)構(gòu)并起始自身RNA的轉(zhuǎn)錄，而且優(yōu)先切割在與RSV RNA3'端多堿基互補(bǔ)的位點(diǎn)。源于CMV的RNA帽子長(zhǎng)度達(dá)到12-20nt(nucleotides)時(shí)可以起始RSV長(zhǎng)距離轉(zhuǎn)錄，但長(zhǎng)度為12-16nt的RNA前導(dǎo)序列最適合RSV長(zhǎng)距離轉(zhuǎn)錄起始，可產(chǎn)生了更多的CMV-RSV嵌合體。雖然從CMV RNA切割而來(lái)的初始帽子長(zhǎng)度較短(10-13nt)，

5、但是這些源于CMV帽子結(jié)構(gòu)、可起始RSV mRNA長(zhǎng)距離轉(zhuǎn)錄的RNA前導(dǎo)序列包含多達(dá)5個(gè)額外的AC重復(fù)。經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)這些AC重復(fù)通過(guò)引物重配機(jī)制添加到CMV RNA初始的、較短的帽子上，而且每經(jīng)歷一次引物重配即可增加一個(gè)AC到RNA帽子結(jié)構(gòu)上，如此循環(huán)，較短的RNA帽子逐步增長(zhǎng)至較長(zhǎng)的帽子結(jié)構(gòu)(12-20nt)。值得注意的是，源于CMV RNA1/2的初始RNA帽子（10或11nt）不可以直接進(jìn)行轉(zhuǎn)錄延伸，只有當(dāng)其帽子長(zhǎng)度增至12nt

6、以上才可以被用于直接延伸。這些結(jié)果表明引物重配機(jī)制可以使較短的CMV RNA帽子序列逐步增長(zhǎng)至較長(zhǎng)且合適長(zhǎng)度的RSV RNA帽子結(jié)構(gòu)，從而促使形成較穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體，有利于RSV RNA轉(zhuǎn)錄起始并長(zhǎng)距離延伸。
　　2.RSV NSvc2蛋白在植物細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位研究
　　纖細(xì)病毒屬病毒與布尼亞病毒科病毒具有極高的親緣關(guān)系，但是纖細(xì)病毒的病毒粒子呈細(xì)絲狀且不具包膜，而布尼亞病毒的病毒粒子是具包膜的球狀粒子。在布尼亞病毒的

7、球狀病毒粒子形成過(guò)程中其糖蛋白起了十分重要的作用，是決定病毒粒子形態(tài)的關(guān)鍵因子。RSV基因組RNA2的互補(bǔ)鏈vcRNA2編碼的一個(gè)多聚蛋白R(shí)SV NSvc2蛋白與布尼亞病毒的糖蛋白具有很高的同源性，且具有許多共同的特征，但病毒粒子形態(tài)卻截然不同，是否是其糖蛋白的特性發(fā)生改變從而導(dǎo)致其病毒粒子形態(tài)的變化。
　　為了闡明這個(gè)問(wèn)題，首先通過(guò)序列分析發(fā)現(xiàn):RSV NSvc2蛋白具有4個(gè)跨膜區(qū)域（6-26aa、269-291aa、362-3

8、79aa和807-827aa），其中2個(gè)區(qū)域是信號(hào)肽(1-18aa和362-379aa)，而且其成熟過(guò)程在382aa位點(diǎn)發(fā)生切割形成NSvc2-N(41kDa)和NSvc2-C(51kDa)兩個(gè)成熟蛋白。為了進(jìn)一步明確RSV病毒粒子形態(tài)的成因，本研究在本氏煙中更深入地研究了NSvc2的特征，結(jié)果發(fā)現(xiàn):在RSV自然侵染水稻和本氏煙的過(guò)程中糖蛋白NSvc2的確發(fā)生切割，形成兩個(gè)成熟蛋白NSvc2-N和NSvc2-C，而且NSvc2-N單獨(dú)表

9、達(dá)時(shí)定位于高爾基體，而NSvc2-C單獨(dú)表達(dá)時(shí)卻積累于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，但是一旦二者共同表達(dá)時(shí)，NSvc2-N即可把NSvc2-C從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)招募到高爾基體上，而且這種從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)是依賴有功能的細(xì)胞早期分泌途徑COPⅠ和COPⅡ，且定位于高爾基體的NSvc2可與高爾基體一起沿著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運(yùn)動(dòng)。進(jìn)一步通過(guò)缺失和重組嵌合突變體發(fā)現(xiàn)NSvc2的高爾基體定位信號(hào)位于NSvc2-N的C端區(qū)域(269-315aa)，涵蓋了NSvc2-N跨膜區(qū)和相鄰的24