水稻條紋病毒編碼蛋白在Sf9細(xì)胞中的表達(dá)與定位.pdf

1、水稻條紋病毒(Rice stripe virus,RSV)是纖細(xì)病毒屬的代表種,近年來,由其引起的水稻條紋葉枯病在我國多次爆發(fā)流行,嚴(yán)重危害我國的水稻生產(chǎn),造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。RSV是一種具有雙義編碼特征的多組分RNA病毒,其基因組由4種單鏈RNA(single-stranded RNA,ssRNA)組成,按照大小依次命名為RNA1,RNA2,RNA3和RNA4,RSV共編碼7個蛋白,即依賴于RNA的RNA聚合酶(RdRp)、NS2、

2、NSvc2、CP、NS3、SP和NSvc4。
　　 提取RSV侵染的水稻病葉的總RNA,經(jīng)RT-PCR(reverse transcription PCR)擴(kuò)增,獲得C端融合有Strep標(biāo)簽的RSV基因NS2、NSvc2-N、CP、SP和NSvc4,將所獲得的基因分別克隆到載體pMD-18T上,得到重組子pMD-NS2、pMD-NSvc2-N、pMD-CP、pMD-SP和pMD-NSvc4,經(jīng)酶切和測序鑒定正確后,將所得到的重組

3、質(zhì)粒和桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBacl分別用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ／KpnⅠ進(jìn)行雙酶切,連接反應(yīng)后得到重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFB-NS2、pFB-NSvc2-N、pFB-CP、pFB-SP和pFB-NSvc4,序列測定后表明目的基因準(zhǔn)確地插入到載體pFastBac1上。然后,將所獲得的重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞,以獲得重組bacmid DNA,即rbpFB-NS2、rbpFB-NSvc2-N、rbpFB-CP、rbp

4、FB-SP和rbpFB-NSvc4。將獲得的重組bacmid DNA分別轉(zhuǎn)染St9昆蟲細(xì)胞,72h后收集細(xì)胞,通過Western blotting檢測目的蛋白的表達(dá)情況,并通過免疫熒光實(shí)驗觀察目的蛋白在Sf9細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位。重組桿狀病毒rbpFB-NS2侵染的Sf9昆蟲細(xì)胞,綠色熒光主要分布在細(xì)胞膜；重組桿狀病毒rbpFB-NSvc2-N侵染的Sf9昆蟲細(xì)胞,綠色熒光主要以囊泡狀的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中；重組桿狀病毒rbpFB-SP侵染

5、的Sf9昆蟲細(xì)胞,綠色熒光分布在整個細(xì)胞質(zhì)中；重組桿狀病毒rbpFB-NSvc4侵染的Sf9昆蟲細(xì)胞,綠色熒光主要以絲狀形式定位在細(xì)胞周質(zhì)中；重組桿狀病毒rbpFB-CP侵染的Sf9昆蟲細(xì)胞,綠色熒光主要以不規(guī)則的點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)分布于細(xì)胞質(zhì)中。
　　 細(xì)胞是生命形式的基本組成單位,而蛋白質(zhì)是生命活動的直接體現(xiàn)者。由于細(xì)胞被劃分為不同的分區(qū),所以成熟的蛋白只有在特定的細(xì)胞部位才能夠發(fā)揮其正常的生物學(xué)功能,蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位方面的信息能夠強(qiáng)