馬立克氏病患雞錯(cuò)配修復(fù)基因MLH1基因突變和蛋白表達(dá)的研究.pdf

1、雞馬立克氏病(Marek's disease，MD)是由馬立克氏病毒(Marek's disease virus，MDV)引起的一種雞的惡性淋巴腫瘤疾病，是雞的三大腫瘤病之一。目前乃至將來相當(dāng)長的一段時(shí)間里它在養(yǎng)雞業(yè)中都具有重要的經(jīng)濟(jì)意義。錯(cuò)配修復(fù)基因(mismathrepair gene，MMR)是細(xì)胞內(nèi)負(fù)責(zé)對堿基錯(cuò)配進(jìn)行修復(fù)的基因，它們的缺陷會導(dǎo)致腫瘤相關(guān)基因的突變不能被及時(shí)有效糾正，從而使得宿主易感腫瘤。此類基因中MLH1和MSH

2、2占主要地位，它們的功能是在生理狀況下可以表達(dá)豐富的蛋白產(chǎn)物來維持基因的穩(wěn)定性，當(dāng)其發(fā)生突變、缺失或其他改變時(shí)，會影響其正常表達(dá)，出現(xiàn)錯(cuò)配修復(fù)功能障礙，其表現(xiàn)為不能對宿主DNA的堿基的轉(zhuǎn)換和顛換突變進(jìn)行識別和修復(fù)，因而使某些抑癌基因失活或一些腫瘤基因被激活，最終導(dǎo)致宿主細(xì)胞凋亡或腫瘤形成。本試驗(yàn)是對健康雞的MMRMLH1基因以及對患MD雞的腫瘤組織中的MLH1基因突變情況和蛋白表達(dá)情況進(jìn)行研究。旨在探索雞的MLH1基因與MD腫瘤發(fā)生的關(guān)

3、系。
　　 試驗(yàn)分兩大部分，第一部分是檢測了MLH1基因的19對外顯子基因突變情況，具體操作是先通過HE染色確定患雞的腫瘤組織和正常組織，再分別從中提取DNA，以NCBI上公布的MLH1基因DNA序列的19對外顯子序列來設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，確定為目的條帶后，通過PCR-SSCP技術(shù)來檢測MD同一只雞的肌肉組織和內(nèi)臟組織間有無條帶的差異，來推測MLH1基因是否存在基因突變。結(jié)合SSCP和病理切片

4、結(jié)果，提取病灶明顯的同一只雞的腫瘤組織和健康組織的DNA，并以其為模板，MLH1基因的19對外顯子引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)驗(yàn)證條帶單一后，擴(kuò)大PCR體系并將產(chǎn)物純化后測序分析。用DNAstar軟件對正常組織和腫瘤組織的DNA序列測序結(jié)果進(jìn)行比對，尋找確定是否存在核酸層次的改變（堿基改變、插入、缺失等）和氨基酸層次的改變，判定MLH1基因有無基因突變。第二部分用免疫組化染色方法檢測MLH1基因在MD腫瘤組織中的蛋白表達(dá)情況，鑒別腫瘤細(xì)胞的

5、類型。具體做法是將福爾馬林固定的腫瘤組織做常規(guī)的石蠟切片，分別進(jìn)行（蘇木精伊紅）HE和免疫組化（常規(guī)IHC和T/B淋巴細(xì)胞）染色，檢測腫瘤病灶和灶旁組織的MLH1基因表達(dá)情況。
　　 試驗(yàn)結(jié)果為通過PCR-SSCP檢測，未檢測到有條帶的差異，即未檢測到MLH1有基因突變。通過HE染色發(fā)現(xiàn)2號雞的肝臟組織呈現(xiàn)結(jié)節(jié)性病灶，對其提取DNA并進(jìn)行測序，經(jīng)過軟件DNA star比對后，肝臟腫瘤和健康組織的DNA序列未發(fā)現(xiàn)有差異，即從核酸層