大菱鲆紅體病的病原檢測(cè)研究.pdf

1、大菱鲆是我國(guó)一種重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)，但是近年來(lái)大菱鲆紅體病的頻繁暴發(fā)，已嚴(yán)重影響了大菱鲆的健康養(yǎng)殖。大菱鲆紅體病通常表現(xiàn)為鰭基部和腹面脊椎骨沿線充血發(fā)紅。但是，人們隨后發(fā)現(xiàn)大菱鲆紅體病的病原是多樣性的，既有病毒性的，也有細(xì)菌性的，甚至某些寄生蟲(chóng)的感染也使大菱鲆呈現(xiàn)相似的紅體癥狀，因而給大菱鲆紅體病的及時(shí)診治帶來(lái)極大的困難。因此，運(yùn)用可靠有效的大菱鲆病原檢測(cè)技術(shù)和方法，及時(shí)診斷大菱鲆紅體病病原，以對(duì)癥下藥，對(duì)于保證大菱鲆養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)

2、展具有一定的意義。
　　本文于2011年3月、9月、10月和12月以及2012年1月，分別從山東半島沿海的4個(gè)大菱鲆養(yǎng)殖場(chǎng)先后收集了5個(gè)批次的疑似紅體病的患病大菱鲆，對(duì)其分別進(jìn)行了病理癥狀觀察和病原檢測(cè)，共發(fā)現(xiàn)了3種病例，即細(xì)菌性紅體病、病毒性紅體病以及弧菌與病毒混合感染紅體病。
　　病理癥狀觀察的結(jié)果表明，2012年1月所收集病魚(yú)的癥狀不屬于紅體癥狀，其他4個(gè)批次患病大菱鲆均呈現(xiàn)明顯的紅體癥狀，其無(wú)眼側(cè)皮膚均可見(jiàn)到不同程度

3、的皮下組織出血發(fā)紅，但不同病原所引發(fā)的紅體病癥狀存在一定的差異：由致病性弧菌感染致病的紅體大菱鲆，其鰓絲為鮮紅色，而感染病毒的紅體大菱鲆，鰓絲通常為暗紅色，或是呈貧血灰暗?？梢?jiàn)，鰓絲顏色是否灰暗貧血是病毒性紅體病區(qū)別于細(xì)菌性紅體病較明顯的病理特征。另外，當(dāng)病情嚴(yán)重時(shí)，皮膚潰爛流血是細(xì)菌性紅體病的最有力的病理特征。
　　水浸片光鏡檢測(cè)寄生蟲(chóng)的結(jié)果顯示，所有批次的病魚(yú)中均未檢測(cè)到寄生蟲(chóng)，因此，可以確定的是，所檢各批次大菱鲆紅體病都不是

4、由寄生蟲(chóng)感染所引起的?；【x擇性培養(yǎng)基檢測(cè)致病性弧菌的結(jié)果表明，2011年9月、10月和12月所收集的3個(gè)批次的紅體大菱鲆均感染了弧菌，選擇性培養(yǎng)基TCBS培養(yǎng)基上均長(zhǎng)出黃色的弧菌菌落。電鏡負(fù)染檢測(cè)和組織超薄切片電鏡檢測(cè)的結(jié)果顯示，2011年3月和12月收集到的紅體大菱鲆均檢測(cè)到了病毒粒子。因此，病原檢測(cè)的診斷結(jié)果為，9月和10月收集的大菱鲆紅體病為細(xì)菌性紅體?。?月份收集的紅體大菱鲆為病毒性紅體??；而12月份收集的紅體大菱鲆既感染了弧

5、菌，又檢測(cè)到了病毒，因此該批次大菱鲆為弧菌和病毒混合感染紅體病。
　　在大菱鲆病毒性紅體病和混合感染紅體病中，所觀察到的病毒粒子的形態(tài)結(jié)構(gòu)均一致。病灶組織所制備的病毒粗提液經(jīng)負(fù)染，在電鏡下觀察到球形的病毒顆粒，直徑為120~130nm，有的具囊膜，有的無(wú)囊膜。在病魚(yú)皮膚病灶組織的電鏡切片中也觀察到病毒粒子，位于感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，病毒顆粒為球形，直徑約130nm，與負(fù)染結(jié)果一致，同時(shí)還觀察到感染細(xì)胞內(nèi)的線粒體腫脹，嵴崩解。

6、　　采用細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic effect，CPE）檢測(cè)方法驗(yàn)證了分離出的病毒粒子能夠使牙鲆鰓細(xì)胞（FG）出現(xiàn)CPE效應(yīng)。本文用病毒粗提液去感染FG單層培養(yǎng)細(xì)胞，3天后細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變效應(yīng)：細(xì)胞變圓、脫落；9天后，大量細(xì)胞變圓、脫落和聚縮成團(tuán)，細(xì)胞病變效應(yīng)加??；11天后，大部分細(xì)胞崩解死亡。可見(jiàn)CPE現(xiàn)象隨著時(shí)間的推移而逐漸加劇，最終導(dǎo)致細(xì)胞系統(tǒng)崩解。同時(shí)采用電鏡觀察了病變FG細(xì)胞的病理變化，雖然在感染病毒的FG細(xì)胞

7、中未觀察到典型的病毒粒子，但發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中溶酶體和次級(jí)溶酶體增多增大，細(xì)胞質(zhì)勻質(zhì)化并形成大量空泡，并有疑似病毒包涵體的結(jié)構(gòu)，而且病變細(xì)胞的體積比對(duì)照細(xì)胞肥大。本文用病變細(xì)胞上清培養(yǎng)液制備成的病毒濃縮液去感染正常FG細(xì)胞，也出現(xiàn)CPE現(xiàn)象，只是CPE現(xiàn)象推遲了4天，由此證明了新擴(kuò)增的病毒仍具有侵染力，但其感染力有所下降。
　　綜上所述，本文采用水浸片光鏡觀察、電鏡檢測(cè)（負(fù)染和病灶組織超薄切片觀察）、弧菌選擇性培養(yǎng)、牙鲆鰓細(xì)胞系病變效應(yīng)檢