重慶地區(qū)牛附紅體病分子流行病學(xué)調(diào)查及黃牛附紅體RAPD—SCAR標(biāo)記的建立.pdf

1、附紅細(xì)胞體(Eperythrozoon)寄生于宿主的紅細(xì)胞表面或游離于血漿、組織液及腦脊液中。可感染山羊、牛、豬、馬、綿羊、鼠、犬、藍(lán)狐、雞等多種動(dòng)物及人類。對(duì)世界多數(shù)國(guó)家的畜禽業(yè)養(yǎng)殖造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失。本研究根據(jù)Genbank上公布的牛附紅細(xì)胞體16S rRNA基因序列進(jìn)行牛附紅細(xì)胞體16S rRNA基因擴(kuò)增的特異性引物設(shè)計(jì)。直接對(duì)感染了牛附紅細(xì)胞體的牛全血DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，成功擴(kuò)增出黃牛、奶牛和水牛的16S rRNA基因序列，

2、建立了關(guān)于牛附紅細(xì)胞體病更為簡(jiǎn)便的試驗(yàn)室診斷方法。通過(guò)對(duì)擴(kuò)增出的黃牛、奶牛和水牛感染的附紅細(xì)胞體部分16S rRNA基因的序列測(cè)定與分析，發(fā)現(xiàn)在不同品種牛感染的附紅細(xì)胞體均屬于溫氏附紅細(xì)胞體，但存在一定的遺傳差異，其中黃牛與水牛感染的附紅細(xì)胞體16S rRNA基因相似率為98.6％；黃牛與奶牛感染的附紅細(xì)胞體16S rRNA基因相似率為98.3％；而奶牛與水牛感染的附紅細(xì)胞體16S rRNA基因同源性最高，其相似率為99.8％。表明建立

3、的PCR特異性檢測(cè)方法可以用于鑒別牛血液是否感染了附紅細(xì)胞體。 根據(jù)重慶地區(qū)不同的地理?xiàng)l件和養(yǎng)殖模式，在重慶地區(qū)選擇14個(gè)區(qū)縣進(jìn)行牛附紅細(xì)胞體病的分子流行病學(xué)調(diào)查，使用本試驗(yàn)室建立的牛附紅細(xì)胞體特異性檢測(cè)方法與常規(guī)試驗(yàn)室檢測(cè)方法相結(jié)合，調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重慶市的大部分區(qū)縣牛體均有牛附紅細(xì)胞體的存在，其平均感染率為11％。而在不同的地理?xiàng)l件下該病的感染率存在較大的差異，其中以城口、武隆、秀山等為代表的山區(qū)牛附紅細(xì)胞體的平均感染率明顯(

4、25.6％)高于以榮昌、北碚、江北為代表的丘陵地區(qū)平均感染率(2％)，同時(shí)，不同的養(yǎng)殖模式條件下感染率也存在一定的差異，散養(yǎng)方式下牛的感染率在22.7％-33.3％之間，而規(guī)模化養(yǎng)殖條件下的平均感染率為6％。 關(guān)于附紅細(xì)胞體分類，主要依據(jù)對(duì)附紅細(xì)胞體的16S rRNA基因擴(kuò)增和序列比對(duì)結(jié)果分析進(jìn)行判定，但Pospischil A，Neimark H等人用16S rRNA基因分類卻得出不同的意見。表明僅使用16S rRNA基因擴(kuò)增

5、和序列比對(duì)分析對(duì)附紅細(xì)胞體進(jìn)行分類判斷具有一定的局限性。本試驗(yàn)利用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)(RAPD)對(duì)E．wenyoni， E．suos和E．vois三種附紅細(xì)胞體16S rRNA基因序列進(jìn)行分析。利用篩選出的4條隨機(jī)引物對(duì)5條E． wenyonii16S rRNA基因序列、2條E．suis16S rRNA和2條E． vois16s rRNA基因序列進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果顯示相同品種家畜體內(nèi)感染的附紅細(xì)胞體擴(kuò)增條帶十分一致，不同動(dòng)物感染的

6、附紅細(xì)胞體擴(kuò)增條帶存在差異，其中感染牛、羊的附紅細(xì)胞體16S rRNA基因序列親緣關(guān)系最近，其遺傳距離指數(shù)為0.405；感染牛和羊的附紅細(xì)胞體與感染豬的附紅細(xì)胞體16S rRNA基因序列的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，其遺傳距離指數(shù)分別為0.714和0.673，表明RAPD技術(shù)可用于對(duì)不同種畜間附紅細(xì)胞體16S rRNA基因序列進(jìn)行遺傳距離分析，但不能應(yīng)用于對(duì)同種動(dòng)物感染的附紅細(xì)胞體16S rRNA基因序列進(jìn)行遺傳距離分析。在對(duì)黃牛附紅細(xì)胞體16S

7、 rRNA基因序列RAPD分析的基礎(chǔ)上，進(jìn)行SCAR標(biāo)記的轉(zhuǎn)化，發(fā)現(xiàn)建立的SCAR1和SCAR3標(biāo)記既不能對(duì)E． wenyonii16S rRNA基因序列擴(kuò)增出特異性條帶，也不能在其它感染了牛附紅細(xì)胞體的血液DNA中擴(kuò)增山特異性條帶，而SCAR2既可以作為鑒別黃牛是否感染了附紅細(xì)胞體病的分子標(biāo)記，也可以從感染黃牛、水牛和奶牛的附紅細(xì)胞體16S rRNA基因序列中鑒別出黃牛感染的附紅細(xì)胞體16S rRNA基因序列。表明RAPD—SCAR方