日本囊對蝦熱休克蛋白HSP60基因克隆表達、多態(tài)性與耐熱性狀的關系.pdf

1、日本囊對蝦（Marsupe naeus japonicus）是我國重要經(jīng)濟養(yǎng)殖蝦類，但其在南方地區(qū)存在著高溫度夏死亡率較高的養(yǎng)殖難題。因此，急需了解日本囊對蝦的耐熱性狀及耐溫的分子機制，為此，我們開展了日本囊對蝦MjHSP60基因的克隆、表達分析及其多態(tài)性與耐熱性狀相關性的研究，獲得了如下主要結果:
　　1.MjHSP60基因克隆
　　在日本囊對蝦MjHSP60 cDNA序列基礎上克隆到了該基因DNA全序列。日本囊對蝦MjH

2、SP60基因全長4055 bp，結構與擬穴青蟹一致，均由8個外顯子及7個內含子構成，且對應的外顯子長度極其相近，序列相似度達94％，而內含子長度存在較大差異。
　　2.MjHSP60 mRNA在日本囊對蝦幼體階段的表達
　　利用qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)MjHSP60在幼體發(fā)育階段均有表達，包括:卵、無節(jié)幼體、溞狀幼體、糠蝦幼體及仔蝦，說明其在日本囊對蝦幼體發(fā)育中有重要作用。但各發(fā)育階段表達量存在顯著差異，總體上，從卵到糠蝦幼體

3、階段的MjHSP60平均表達水平高于仔蝦期，但表達水平呈現(xiàn)較大波動，且各期最低表達水平均出現(xiàn)在從一種形態(tài)轉變到另一種形態(tài)的過渡期。推測其早期發(fā)育階段MjHSP60表達量的變化與日本囊對蝦形態(tài)變化、生活習性的轉變等有關。
　　3.日本囊對蝦耐熱性狀研究
　　耐熱性狀在日本囊對蝦種內與其他蝦類種間都存在差異。首先，日本囊對蝦種內不同大小的個體間耐熱性存在差異，其體重與耐熱性之間呈顯著負相關(P＜0.05)，特別是日本囊對蝦仔蝦(

4、＜0.01g)的耐熱性(UTT)顯著高于1～5g日本囊對蝦(P＜0.05）。另外，日本囊對蝦的耐熱性狀與其它蝦類物種之間也存在明顯差異，日本囊對蝦仔蝦耐熱性低于凡納濱對蝦但高于脊尾白蝦。
　　4.日本囊對蝦2種形態(tài)變異類型遺傳結構的分析
　　以臺灣澎湖、福建詔安、廣西北海、海南三亞4個群體2種形態(tài)變異類型日本囊對蝦為實驗對象，利用直接測序法共篩選獲得42個單核苷酸多態(tài)性位點(SNP)，其中25個SNP位點位于內含子區(qū)，17個

5、位于外顯子區(qū)，13個為同義突變，4個為非同義突變。4個地理群體平均觀測雜合度（Ho）為0.1508～0.2444，平均期望雜合度(He）為0.1493～0.2633，表明群體遺傳多樣性水平較低。屬于同種形態(tài)變異類型各群體間的Fst值均小于0.05，遺傳分化不顯著;而屬于不同種形態(tài)變異類型各群體間Fst值則較大，在0.2564～0.3471之間，表明遺傳分化程度很高，結合Nm值(0.100374～0.208228)分析表明有限的基因交流是

6、2種形態(tài)變異類型群體發(fā)生遺傳分化的主要原因。日本囊對蝦群體間的遺傳距離(DA)為0.0088～0.1492，基于遺傳距離構建的UPGMA聚類圖顯示，北海、三亞群體聚為一支，澎湖、詔安群體聚為另一支，2個分化類群的地理分布與Tsoi的2個類型相符合。
　　5.日本囊對蝦MjHSP60基因SNP與耐熱性的相關性
　　由于不同形態(tài)變異類型日本囊對蝦的耐熱性不同，本研究以VarietyⅠ群體作為熱敏感群體，VarietyⅡ群體作為耐

7、熱群體，進行MjHSP60基因SNP與耐熱性的相關分析。檢測發(fā)現(xiàn)有3個位點(-213、-1541、-3061)在VarietyⅠ中的分布偏離Hardy-Weinberg平衡(HWE)，2個位點(-212、-2060)在VarietyⅡ中的分布偏離HWE，而位點-2011在兩個群體中的分布均偏離HWE，其余位點在兩個群體中的分布均符合HWE。除了2個位點不同基因型(-282、-2011)在兩個群體中的差異不顯著外，其余位點在兩群體中的差異

8、均達到顯著(P＜0.05)或極顯著（P＜0.01）水平，表明在這些位點中可能找到與日本囊對蝦耐熱性相關的潛在SNP標記。
　　另外，各多態(tài)性位點之間存在不同程度的連鎖不平衡，提示該基因存在與日本囊對蝦耐熱性相關的單體型。對31種頻率＞3％的單體型在2種形態(tài)變異類型中的分布頻率進行分析發(fā)現(xiàn)，15種單體型在VarietyⅡ中的分布頻率顯著高于VarietyⅠ，并且其中2種單體型為VarietyⅡ所特有，提示在這些單體型中可能找到與日本