豬流感病毒H1N1亞型單克隆抗體的制備與膠體金試紙條的研制.pdf

1、本研究用豬流感病毒H1N1亞型對9-11日齡雞胚進(jìn)行尿囊腔接種，劑量為100μl/枚，培養(yǎng)72小時(shí)后收集雞胚尿囊液，HA試驗(yàn)檢測其HA血凝效價(jià)為28。用4％的甲醛對新培養(yǎng)的H1N1亞型病毒進(jìn)行滅活，然后免疫6-8周齡的BALB/C，每只小鼠免疫滅活H1N1亞型流感病毒150μl/只，以后每隔14d加強(qiáng)免疫一次，在二次免疫后10d取尾靜脈血，利用HI試驗(yàn)檢測其HI抗體效價(jià)為26，取免疫小鼠脾臟與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行細(xì)胞融合。
　

2、　 建立篩選陽性克隆細(xì)胞的間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(iELISA)篩選方法，確定包被抗原的最佳稀釋倍數(shù)為1:100,4℃包被過夜，以1:800稀釋陰陽性血清作為陰陽性對照，反應(yīng)條件為37℃1.5h效果最佳，酶標(biāo)二抗1:3000稀釋最佳反應(yīng)時(shí)間為1h。用所建立的iELISA篩選方法對融合的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選，結(jié)果共獲得陽性雜交瘤細(xì)胞24株。利用有限稀釋法對陽性細(xì)胞株進(jìn)行亞克隆，(每株單抗至少有兩次為單個(gè)克隆)后，用iELISA進(jìn)一步檢測篩選

3、，最終獲得9株能穩(wěn)定分泌抗H1N1亞型抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為A10、D1、D3、E2、FA、H1、H8、G5、G7。對這9株單克隆抗體用iELISA分別進(jìn)行了腹水效價(jià)、特異性、抗體亞型進(jìn)行了檢測，結(jié)果如下：A10、D1、H8的抗體效價(jià)為51200,D3、G5為3200,E2、H1、G7的抗體效價(jià)為12800,FA的抗體效價(jià)為25600；特異性良好，其中A10、D3、E2、EA、H1、H8、G5、G7均與血凝素H1呈陽性反應(yīng)，D1

4、與神經(jīng)氨酸酶N1呈陽性反應(yīng)。與其它HA亞型流感病毒、NA亞型流感病毒以及非流感病毒均不反應(yīng)；經(jīng)亞型鑒定，A10、H1為IgG2a，G7為IgM，D1、D3、E2、E4、H8、G5均為IgG1；用吉姆薩染液染色對克隆細(xì)胞株進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)，結(jié)果染色體他數(shù)目均介于100-110之間，具有雜交瘤細(xì)胞典型的染色體特征。為制作膠體金檢測試紙條選擇配對抗體，對所獲得的克隆株進(jìn)行了抗原位點(diǎn)檢測，經(jīng)抗原位點(diǎn)檢測顯示D3與G5，E4與H8對應(yīng)病毒的相同抗原

5、位點(diǎn)，其他單克隆抗體均對應(yīng)不同的抗原位點(diǎn)，其中A10與D1的疊加系數(shù)(AI)值為90.5％，配對關(guān)系良好，所以選擇用A10與D1制備檢測H1N1亞型流感病毒的膠體金試紙條。
　　 用檸檬酸鈉還原法制備膠體金顆粒，通過對于A10株單抗腹水的稀釋確定了膠體金的最低穩(wěn)定量，成功制備了金標(biāo)抗體，經(jīng)過不斷摸索確定了NC膜的最佳包被單抗為D1，包被濃度為1:2稀釋，羊抗鼠的酶標(biāo)二抗的包被濃度為1:20稀釋。分別選擇CB06、KL43制備膠體