雄激素刺激母鹿生茸區(qū)骨膜發(fā)育前后的差異蛋白篩選與分析.pdf

1、鹿茸是雄性鹿科動物的第二性征，是唯一可以完全再生的哺乳動物附屬器官。鹿茸發(fā)生是指雄性仔鹿進入青春期后角柄和初角茸的形成過程。鹿額外脊上的生茸區(qū)骨膜(AntlerogenicPeriosteum，AP)是鹿茸發(fā)生的組織基礎。AP包含了鹿茸器官發(fā)育的藍圖。雄激素在鹿茸發(fā)生中起到重要作用，AP只有受到雄激素刺激以后才能發(fā)育形成角柄和初角茸。
　　Li.C等研究發(fā)現(xiàn)仔公鹿去勢則導致鹿茸發(fā)生失敗，如果注射外源性雄激素則會使去勢仔鹿的AP重新

2、發(fā)育形成角柄進而成為鹿茸;同時雌鹿也有AP發(fā)育為角柄的潛力，但雌鹿因沒有足夠的雄性激素刺激而無法表達這一性狀。雄激素是刺激鹿茸發(fā)生的先決條件，AP發(fā)育生長為鹿茸這一過程具有雄激素濃度的依賴性。AP發(fā)育形成鹿茸角柄是由體內(nèi)雄激素水平的增加引起的，AP發(fā)育與睪酮濃度的變化密切相關。為探索鹿茸生長過程中有無雄激素刺激AP蛋白表達的差異，利用2D DIGE技術篩選生茸區(qū)骨膜發(fā)育前后的差異蛋白。深入研究鹿茸生茸區(qū)骨膜發(fā)育蛋白質(zhì)組學，將為揭示鹿茸發(fā)

3、生的分子機制提供基本根據(jù)。
　　1.雄激素誘導雌性梅花鹿生茸區(qū)骨膜發(fā)育
　　選取兩頭健康一歲齡幼母鹿，試驗組雌鹿注射外源性雄激素（十一酸睪酮），對照組注射用于溶解雄激素的茶樹油，二者皆為每隔一周注射，持續(xù)一個月后，利用角柄發(fā)生檢測器檢測鹿茸角柄是否發(fā)育，采集生茸區(qū)骨膜進行HE染色。結果顯示試驗組雌鹿鹿茸生茸區(qū)骨膜發(fā)育，發(fā)育的AP細胞層明顯增厚。對照組生茸區(qū)骨膜未見發(fā)育，梅花鹿母鹿同公鹿一樣具有生發(fā)角柄和鹿茸的組織學基礎，雄激

4、素是調(diào)控鹿茸生長的關鍵因子，人工誘導母鹿生茸區(qū)骨膜發(fā)育是研究鹿茸生長調(diào)控機制的優(yōu)良模型。
　　2.鹿茸生茸區(qū)骨膜發(fā)育前后差異表達蛋白的蛋白質(zhì)組學分析
　　提取梅花鹿母鹿生茸區(qū)骨膜發(fā)育前后樣品骨膜組織總蛋白，2D DIGE試驗和質(zhì)譜鑒定;總結質(zhì)譜鑒定結果數(shù)據(jù)，對差異表達的組織蛋白進行生物信息學分析。通過生茸區(qū)骨膜組織總蛋白的2D DIGE分析，具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05，差異倍比≥1.5)的差異蛋白質(zhì)點318個，其中有163

5、個蛋白在發(fā)育后的生茸區(qū)骨膜蛋白中上調(diào)表達，155個蛋白在發(fā)育后的生茸區(qū)骨膜中下調(diào)表達。最終鑒定出17個可用的組織差異蛋白，按功能分類主要有結合相關蛋白，酶調(diào)活性相關蛋白，結構分子活性相關蛋白，催化活性相關蛋白，抗氧化活性相關蛋白。獲得部分差異明顯的生茸區(qū)骨膜發(fā)育前后骨膜組織蛋白組表達譜，與未發(fā)育生茸區(qū)骨膜相比，在發(fā)育后的生茸區(qū)骨膜蛋白中有10個骨膜蛋白下調(diào)表達，有7個骨膜蛋白上調(diào)表達，這些蛋白很有可能參與了生茸區(qū)骨膜的發(fā)育過程，是觸發(fā)鹿

6、茸形成的關鍵蛋白，發(fā)現(xiàn)14-3-3ε、GSN、COL6A2、ERBBFI1等蛋白與鹿茸發(fā)生過程密切相關。
　　3.生茸區(qū)骨膜發(fā)育相關蛋白14-3-3ε蛋白基因的克隆及生物信息學分析
　　梅花鹿YWHAE基因編碼區(qū)核苷酸全長768 bp，編碼255個氨基酸，氨基酸水平上與牛相似性高達99.6％;氨基酸序列分析表明鹿YWHAE基因編碼的14-3-3￡蛋白相對分子量為29163.86Da，主要定位在細胞質(zhì)內(nèi)，屬于可溶性蛋白;預測鹿