組織胺對新糠蝦和中華絨螯蟹的消化功能、免疫力以及卵巢發(fā)育的影響.pdf

1、中華絨螯蟹在養(yǎng)殖的過程中,魚粉和冰鮮野雜魚常常被作為飼料原料或直接投喂,由于在魚粉的制備工藝或者野雜魚的運輸、儲存不當?shù)仍?往往會導致飼料或者野雜魚的變質(zhì)、腐敗,產(chǎn)生大量的生物胺。而組織胺作為毒性(scombroid poisoning)最大的一種生物胺,常被作為檢測魚粉質(zhì)量以及野雜魚的新鮮度的一個標準,也是食品安全的重要檢測指標。目前已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)攝食組織胺飼料能夠影響甲殼動物的生長,存活以及性成熟,而消化、免疫以及性腺的發(fā)育是維持

2、其正常的生長所必須的基礎(chǔ)。目前已有研究證實,組織胺能夠引起魚以及家禽胃腸道疾病,而有關(guān)組織胺對甲殼動物消化功能的影響未見報道。日本和黑褐新糠蝦常常作為毒性監(jiān)測的良好模式生物,而中華絨螯蟹存在生長周期長以及采樣的局限性,所以本文通過研究組織胺對日本新糠蝦消化、免疫以及卵巢發(fā)育影響進行方法的探索,繼而為組織胺影響中華絨螯蟹的這些生理功能提供具體依據(jù),也是首次探索組織胺影響甲殼動物消化、免疫以及卵巢發(fā)育的機理,也為冰鮮野雜魚的投喂提供科學的指

3、導。
　　(1)消化道和肝胰腺是甲殼動物主要的消化器官,消化組織結(jié)構(gòu)的完整以及消化酶的正常分泌是維持消化功能的關(guān)鍵。通過投喂新糠蝦和中華絨螯蟹不同濃度的組織胺飼料(1000,2000和4000mg/kg組織胺)17d和28d,對消化道和肝胰腺組織結(jié)構(gòu)的組織學分析以及消化酶測定,結(jié)果表明:
　　a.1000mg/kg組織胺均能夠?qū)е滦驴肺r和中華絨螯蟹肝胰腺上皮細胞嚴重的脫落、破損甚至基膜分離;4000mg/kg能夠引起其B-c

4、ell顯著增多以及管壁變薄,并且2000mg/kg組織胺能夠引起中華絨螯蟹肝胰腺F-cell和內(nèi)腔上皮細胞凸起的增多;
　　b.而對消化道的組織切片發(fā)現(xiàn),組織胺能夠?qū)е滦驴肺r中腸上皮細胞排列稀疏,破損甚至脫落,其中1000mg/kg濃度組尤為顯著;而4000mg/kg的組織胺能夠引起后腸的管壁變薄以及膜分離;對中華絨螯蟹的中腸以及后腸未見類似影響,但是能夠引起其腸球中部嗜堿性細胞以及相連的網(wǎng)狀組織中的嗜伊紅細胞的變化,其中1000

5、mg/kg能夠減少其腸球中嗜堿性細胞和網(wǎng)狀組織中嗜伊紅細胞,而2000和4000mg/kg的組織胺能分別增加其網(wǎng)狀組織中的嗜伊紅細胞和腸球中的嗜堿性細胞,組織胺對其后腸結(jié)締組織中嗜伊紅細胞以及嵴也有影響,1000mg/kg的嗜伊紅細胞密度與對照組未見差異,但是能夠引起皺襞粘膜層中的嗜伊紅物質(zhì)的增加,而2000和4000mg/kg組的嗜伊紅密度降低。
　　c.對腸球以及后腸的細胞增殖的免疫組化發(fā)現(xiàn),組織胺能夠引起腸球以及后腸嵴中細胞

6、增殖陽性,其腸球中的陽性細胞的變化的規(guī)律與嗜堿性細胞規(guī)律一致,而嵴中的陽性則與其嗜伊紅物質(zhì)一致。而肥大細胞是組織胺釋放的主要細胞,通過肥大細胞特異性染色(甲苯胺藍以及阿爾新藍-番紅染色法)發(fā)現(xiàn),其腸球中的嗜堿性細胞以及后腸結(jié)締組織中的嗜伊紅細胞均呈現(xiàn)甲苯胺藍以及阿爾新藍-番紅著染,并且腸球以及網(wǎng)狀組織中的顆粒呈現(xiàn)組織胺免疫陽性,因此腸球以及后腸中存在類肥大細胞的物質(zhì),可能通過組織胺的釋放影響腸道的組織結(jié)構(gòu)。
　　(2)類胰蛋白酶,

7、淀粉酶以及脂肪酶是甲殼動物主要的消化酶。通過飼喂以上濃度組織胺飼料28d,結(jié)果表明:
　　a.組織胺能夠影響肝胰腺和消化道的消化酶活性,并且肝胰腺中的影響較為顯著,即肝胰腺1000mg/kg組的類胰蛋白酶和脂肪酶在7,14,21和28d均顯著低于對照組(p<0.05),而淀粉酶在7d和14d顯著低于對照組(p<0.05);消化道1000mg/kg組類胰蛋白酶,淀粉酶以及脂肪酶僅分別在7d,7d~21d以及28d顯著低于對照組(p<

8、0.05)。
　　b.而肝胰腺中三種消化酶的影響中,類胰蛋白酶的影響較大。在第7d時,組織胺處理后的肝胰腺的類胰蛋白酶的活性均較對照組(1.76±0.02)U/(mg.prot)有顯著降低(p<0.05),分別為對照組的27.00％(1000mg/kg)、71.79%(2000mg/kg)、57.75%(4000mg/kg),其中1000mg/kg組織胺投喂組,其酶活力較其他兩個組織胺組更為顯著,各組織胺組之間的酶活均存在顯著性差

9、異(p<0.05)。14~28d,除了4000mg/kg酶活性與對照組之間無顯著,其類胰蛋白酶也均顯著低于對照組。而淀粉酶在7d和14d時,組織胺處理后的酶活均低于對照組,并且具有顯著性差異(p<0.05);21d和28d時,其淀粉酶活性與對照組不存在顯著性差異(p>0.05)。脂肪酶在7d的時候,組織胺組的脂肪酶活性均顯著低于對照組(p<0.05),但是各濃度組之間沒有顯著性差異,14~28d時,僅低濃度組(1000mg/kg)與對照

10、組有顯著性差異(p<0.05)。
　　c.并且對肝胰腺類胰蛋白酶進行RT-PCR測定發(fā)現(xiàn)其組織胺對類胰蛋白酶的影響與其mRNA基本一致。
　　(3)通過飼喂以及注射兩種方式對組織胺在中華絨螯蟹肝胰腺,肌肉中的累積發(fā)現(xiàn),注射組織胺濃度為0,1,50,100和200μg/g在96h內(nèi)能夠在肝胰腺和肌肉中出現(xiàn)累積,并且肝胰腺和肌肉中組織胺濃度與注射的濃度呈正比,而飼喂含0,1000,2000和4000mg/kg組織胺飼料28d。發(fā)

11、現(xiàn)肌肉中檢測不到組織胺,而肝胰腺中僅7d組織胺飼喂組組織胺含量均顯著高于對照組。對28d肌肉,肝胰腺以及血清組織胺主要的代謝酶二胺氧化酶(DAO)的酶活性測定發(fā)現(xiàn),肌肉中DAO的酶活顯著高于肝胰腺,這可能是肌肉中檢測不到組織胺的原因。說明組織胺能夠在短期內(nèi)在體內(nèi)累積,并且短期內(nèi)組織胺能夠增加體內(nèi)章魚胺和5-HT的含量,對腐胺則影響無規(guī)律。
　　因此,組織胺能夠?qū)е赂我认偌毎?B-和F-細胞)比例發(fā)生變化以及消化道(中腸以及后腸等)

12、組織結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生損傷,細胞增殖,并且消化酶活性降低,其中1000mg/kg組織胺濃度組影響尤為顯著,組織胺從轉(zhuǎn)錄水平影響肝胰腺中類胰蛋白酶的活性。而組織胺能夠在短期內(nèi)在體內(nèi)累積,并且短期內(nèi)組織胺能夠增加體內(nèi)章魚胺和5-HT的含量,對腐胺則影響無規(guī)律。
　　(4)通過對日本新糠蝦和黑褐新糠蝦對溶藻弧菌的敏感性以及血細胞形態(tài)和組成的比較,發(fā)現(xiàn)日本新糠蝦敏感性較高即96h的累積,而顆粒細胞比例要低于黑褐新糠蝦,但是其形態(tài)更多樣。因而對日本

13、新糠蝦的血細胞形態(tài)進行光鏡和電鏡的觀察發(fā)現(xiàn),其血細胞由三種類型的細胞組成,即透明細胞,半顆粒細胞和顆粒細胞組成,細胞大小依次升高,以顆粒細胞所占比例最多,約占細胞總數(shù)的一半,約為48%,其次為半顆粒細胞,其比例約為31%。比例最小的是透明細胞,僅約為21%,三組間均有顯著性差異(p<0.05),電鏡發(fā)現(xiàn)其顆粒細胞胞質(zhì)中有大量的顆粒物質(zhì)。
　　組織胺水體(0,10,20和40mg/L)浸泡日本新糠蝦30d后,其血細胞中顆粒細胞的比例

14、顯著下降,而胞質(zhì)中的顆粒物質(zhì)明顯減少,并且40mg/L組織胺濃度組的顆粒細胞形態(tài)更加多樣性。組織胺處理之后,對其組織的免疫酶進行測定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)溶菌酶和酚氧化酶活性隨組織濃度上升而顯著下降(p<0.05)而ACP和AKP的活性無顯著影響(p>0.05)。
　　注射中華絨螯蟹的濃度為0,1,50和100μg/g組織胺,1h后注射7.2×108cfu/ml,在12、24、36、48、72和96h的觀察其抵御嗜水氣單胞菌的死亡率,結(jié)果表明

15、
　　96h其組織胺濃度組的死亡率均顯著高于對照組(p<0.05),但是單獨的注射組織胺不會導致中華絨螯蟹死亡,卻能夠引起酚氧化酶(PO)和超氧化物歧化酶(SOD)活性升高(p<0.05),24h總的血細胞數(shù)目(THC)與對照組無顯著差異而磷酸酶(ACP和AKP)則無規(guī)律變化。注射組織胺后,中華絨螯蟹產(chǎn)生明顯的自切和顫抖現(xiàn)象,并且自切率隨著組織胺濃度的上升而上升(p<0.05)。
　　總之,組織胺能夠影響免疫酶以及血細胞的形

16、態(tài)和組成,提高對嗜水氣單胞菌的敏感性,產(chǎn)生自切現(xiàn)象,并且存在種間的差異性。
　　(5)對不同卵巢發(fā)育期的日本新糠蝦雌激素受體的免疫組化發(fā)現(xiàn),卵巢發(fā)育早期其卵母細胞的雌激素受體強烈陽性,因此選取一期的中華絨螯蟹研究組織胺對其卵巢發(fā)育的影響。通過中華絨螯蟹注射組織胺的濃度為0,1,50,100和200μg/g后,96h取其卵巢,進行組織學的研究發(fā)現(xiàn),組織胺能夠影響中華絨螯蟹一期卵巢的卵細胞排列以及形態(tài),并且存在濃度的差異性。其中50μ