甘草細胞放大培養(yǎng)的過程工程研究.pdf

1、甘草是中成藥及配方制劑中用量最大的一味藥，居國藥之首，素有“十方九草”之說。甘草的化學成分復雜，具有多種生物學與藥理學活性，廣泛應用于食品、保健品、化妝品等行業(yè)。近年來野生甘草面臨嚴重的資源問題，而栽培品種周期長、品質低。利用細胞培養(yǎng)技術直接生產(chǎn)植物有效成分是解決野生植物資源短缺有效的方法之一。在實際培養(yǎng)過程中，尚存在很多需要解決的問題，本文以脹果甘草為材料，對甘草細胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)有效成分的可行性、關鍵問題如甘草細胞懸浮培養(yǎng)體系的優(yōu)化

2、控制及反應器放大培養(yǎng)等方面開展了較為系統(tǒng)的研究，取得了以下的研究成果：
　?。?）系統(tǒng)分析了脹果甘草懸浮細胞合成的次生代謝產(chǎn)物。利用HPLC指紋圖譜結合相似度評價系統(tǒng)，構建了脹果甘草懸浮細胞提取物的指紋圖譜，標定指紋峰22個，與野生甘草提取物的指紋圖譜相似度為58.4％；并建立了懸浮細胞中黃酮類化合物的指紋圖譜，標定指紋峰16個，與野生甘草中黃酮類化合物指紋圖譜相似度為75.2%，采用LC-ESI-MS技術初步確定兩個主要黃酮類指

3、紋峰分別為甘草苷與甘草素，同時分別采用HPLC和LC-MS/MS技術檢測了懸浮細胞中查爾酮A和甘草酸的合成。
　?。?）研究了甘草細胞懸浮體系中酶促褐化反應發(fā)生的機理及其有效控制策略。甘草細胞固-液轉化后受到液體懸浮環(huán)境的滲透脅迫和流體剪切壓力，引起細胞膜受傷，導致酚類化合物和多酚氧化酶結合造成酶促褐化的發(fā)生。對于甘草細胞來說，比較有潛力的PPO抑制劑是抗壞血酸和L-半胱氨酸，當0.1 mM的這兩種抑制劑分別被添加到懸浮體系中，褐

4、化現(xiàn)象明顯得到控制，細胞活力得到維持。
　?。?）分析了甘草細胞懸浮體系的流變學特性。獲得不同發(fā)酵時間的流變參數(shù)，建立流變本構方程，為甘草細胞放大培養(yǎng)過程的優(yōu)化操作以及相關的反應器設計和改造提供參考。
　?。?）建立了甘草細胞在攪拌式生物反應器中的放大培養(yǎng)工藝。并對甘草細胞在反應器中懸浮培養(yǎng)的基本特性進行了研究，評價了反應器特有條件下，細胞活力、生物量積累、過氧化氫產(chǎn)量和甘草黃酮合成的變化情況。分別以單因素實驗和正交試驗所得

5、數(shù)據(jù)為樣本，運用BP神經(jīng)網(wǎng)絡耦合遺傳算法獲得反應器中細胞生長的最佳操作參數(shù)。經(jīng)實驗驗證，這種基于神經(jīng)網(wǎng)絡耦合遺傳算法的優(yōu)化方法與傳統(tǒng)的正交試驗方法相比，反應器中細胞的生物量積累提高了6.9%。
　?。?）建立了根癌由農(nóng)桿菌介導的脹果甘草懸浮細胞遺傳轉化體系。并利用該體系，將黃酮類合成途徑中的一個關鍵酶基因-查爾酮異構酶基因，通過構建過表達的pCAMBIA1303-chi重組質粒轉化到脹果甘草懸浮細胞中，得到一個穩(wěn)定的、過表達chi