嗜水氣單胞菌和遲緩愛德華菌適體的SELEX篩選.pdf

1、嗜水氣單胞菌和遲緩愛德華菌是水產養(yǎng)殖中比較常見的兩種致病病原菌，易引起多種水產養(yǎng)殖動物致病或致死，對水產養(yǎng)殖業(yè)造成了重大經濟損失，同時對人也有一定的危害。指數(shù)富集系統(tǒng)進化技術(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX)是一種結合分離、篩選、PCR的組合技術，其模擬達爾文進化過程可篩選到與靶目標結合的適配子。本研究的目的就是利用SELEX技術建立一種快速

2、檢測嗜水氣單胞菌和遲緩愛德華菌的技術，為兩種菌的檢測提供了一種新的檢測方法。
　　 本研究利用體外人工合成一段長為78nt，中間隨機序列為35nt，兩端為固定序列的寡核苷酸文庫，利用已設計出的引物，以嗜水氣單胞菌和遲緩愛德華菌為靶目標，利用SELEX法篩選出能分別與嗜水氣單胞菌和遲緩愛德華菌特異性結合的適體，并用磁珠富集及地高辛-抗地高辛堿性磷酸酶顯色系統(tǒng)(ELISA)，對篩選到的適體進行親和力測定，最后一輪的篩選產物克隆測序后

3、分別對其一級結構及二級結構進行了研究。
　　 1、經過12輪篩選，嗜水氣單胞菌的親和力吸光值由第一輪的0.32升到第9輪的0.72，親和力提高了2.25倍，利用DNAstar軟件分析嗜水氣單胞菌的39個克隆子，按照其與預期長度是否一致分為兩個群體，與預期長度一致的有33條，與預期長度不一致的只有6條，分析發(fā)現(xiàn)保守序列GGTGG存在于所有的39條序列中。對其二級機構分析發(fā)現(xiàn)莖環(huán)結構存在于所有的二級結構中，這可能是適配子與配體結合的

4、構象結構。對嗜水氣單胞菌的39條適配子的二級結構進行分析，按照莖環(huán)出現(xiàn)位置的不同可分為7類。在利用39條適配子分別測親和力的基礎上檢測出嗜水氣單胞菌的最佳適配子，并對嗜水氣單胞菌的最佳適體進行了特異性檢測，其與嗜水氣單胞菌的結合率為0.763，遠高于與其他幾種菌的結合率，證明了篩選到的適體對嗜水氣單胞菌有比較強的特異性。
　　 2、經過14輪的篩選后，遲緩愛德華菌的親和力吸光值由第一輪的0.632上升到第十三輪的1.799，用D

5、NASTAR、DNAMAN軟件分析20條遲緩愛德華菌適體的一級序列與二級結構，20條適體中有17條與預期長度一致，其一級結構主要由GGTGGG、TTTTX、GGAGGX三條保守序列組成。對遲緩愛德華菌的適配子二級結構按照莖環(huán)出現(xiàn)的位置分類可分為5類.通過比較分析其二級結構，發(fā)現(xiàn)二級結構原件中環(huán)是結合位點，而莖則是穩(wěn)定結構，二級結構都是以莖環(huán)狀結構為主，推測莖環(huán)結構可能是適配子的結合關鍵，在二級結構中同樣存在著一些口袋結構，這可能是適配子

6、的結合部位。
　　 3、針對篩選過程中的純化步驟做了一個對比發(fā)現(xiàn)，選擇性純化篩選到的適配子相比每輪都純化得到的適配子，其一級序列的同源性更高，同源性100%的序列出現(xiàn)的頻率較高。通過二級結構分析發(fā)現(xiàn)，每輪純化篩選到的適配子二級結構按照莖環(huán)出現(xiàn)的位置只有5類，而選擇性純化的適配子則有7類，這說明過多的純化會導致適配子篩選豐富性大大降低，對篩選起著弱化作用。
　　 4、篩選到了針對嗜水氣單胞菌和遲緩愛德華菌的特異性適配子，并