MSH1 RNAi干擾載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因芥菜的獲得.pdf

1、作物雜種優(yōu)勢(shì)的利用途徑主要有自交不親和以及雄性不育兩種途徑。由于利用自交不親和系生產(chǎn)雜交種時(shí)，存在自交不親和系多代自交后容易出現(xiàn)衰退且繁殖需要人工蕾期授粉，生產(chǎn)成本高，雜交種純度難以達(dá)到100％等問(wèn)題。因此，選用雄性不育系進(jìn)行雜交制種受到廣泛青睞。芥菜是十字花科重要的蔬菜作物，但芥菜是高度自交親和性的作物，所以芥菜雄性不育系的選育對(duì)生產(chǎn)芥菜雜交種有重要的意義。
　　隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的快速發(fā)展，利用基因工程獲得雄性不育已經(jīng)成為植物雄

2、性不育研究熱點(diǎn)之一，其中細(xì)胞質(zhì)雄性不育（cytoplasmic male sterility，CMS）機(jī)理的研究更是得到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的普遍關(guān)注。一個(gè)已經(jīng)被大家認(rèn)可的觀點(diǎn)是:細(xì)胞質(zhì)雄性不育的基因來(lái)自于線粒體DNA(mtDNA)和葉綠體DNA(ctDNA)。但目前尚無(wú)直接證據(jù)證明葉綠體基因組的變異導(dǎo)致CMS，所以目前研究者們普遍認(rèn)為是線粒體基因組的變異導(dǎo)致了CMS。而研究表明，細(xì)胞核中維持線粒體基因組穩(wěn)定性的基因主要有MSH1、RECA3、以

3、及OSB1，一旦這些基因的功能受到抑制或者破壞，線粒體基因組會(huì)發(fā)生重排，進(jìn)而導(dǎo)致植株表型的變化，甚至是產(chǎn)生細(xì)胞質(zhì)雄性不育。在維持線粒體基因組穩(wěn)定性的MSH1、RECA3、以及OSB1三個(gè)基因中，MSH1的作用最為關(guān)鍵。目前，國(guó)內(nèi)針對(duì)該基因的功能研究尚未開(kāi)始，在十字花科作物芥菜上的研究也更是沒(méi)有。已有研究顯示，MSH1不僅與CMS有關(guān)，也與植株其它的表型變化相關(guān)，例如開(kāi)花延遲、葉綠素含量增加。因此本實(shí)驗(yàn)以“渝豐”榨菜為材料，研究MSH1基

4、因RNAi干擾表達(dá)對(duì)芥菜植株的表型變化的影響，在此基礎(chǔ)上希望通過(guò)轉(zhuǎn)基因手段獲得非轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞質(zhì)雄性不育芥菜，開(kāi)花延遲的芥菜，光合能力提高的芥菜資源。本實(shí)驗(yàn)主要獲得結(jié)果如下:
　　1、從甘藍(lán)的cDNA中克隆得到687bp大小的MSH1目標(biāo)干擾片段，與從甘藍(lán)測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)中拼接的甘藍(lán)MSH1序列進(jìn)行比較，序列相似度達(dá)到98％。該序列與從芥菜基因組克隆得到MSH1相應(yīng)片段序列相比較，兩者同源性高達(dá)的95％。以該片段為基礎(chǔ)，構(gòu)建了以Bar基因

5、為除草劑PPT篩選標(biāo)記基因的RNAi干擾植物表達(dá)載體pCA13BarMSH1RNAi。
　　2、利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將pCA13BarMSH1RNAi表達(dá)載體轉(zhuǎn)入芥菜植株，獲得了7株抗除草劑PPT的轉(zhuǎn)基因芥菜植株。
　　3、獲得的7株T0代轉(zhuǎn)基因芥菜中，無(wú)雄性不育現(xiàn)象被觀察到，但發(fā)現(xiàn)部分植株表現(xiàn)植株分枝增加，植株矮小。其中m-2、m-3、m-5、m-7這4株的分枝增加;m-6植株矮小;而m-1、m-4的表型正常。
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