桉樹(shù)CAD、COMT基因的RNAi載體構(gòu)建及煙草轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、桉樹(shù)是我國(guó)南方主要造紙樹(shù)種，但在制漿造紙過(guò)程中，桉樹(shù)木材的木質(zhì)素去除需消耗大量化學(xué)品，并帶來(lái)嚴(yán)重環(huán)境污染。因而，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育低木質(zhì)素桉樹(shù)造紙樹(shù)種，可從源頭上降低木質(zhì)素含量、減少化學(xué)品消耗和降低污染，具有重大的經(jīng)濟(jì)效益、社會(huì)效益和生態(tài)效益。本文以桉樹(shù)木質(zhì)素合成調(diào)控的2個(gè)關(guān)鍵基因：肉桂醇脫氫酶(CAD)和咖啡酸—O—甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)為對(duì)象，采用RNA干擾技術(shù)，分別構(gòu)建了桉樹(shù)CAD、COMT基因的RNA干擾載體pRi—Ec—CAD

2、和pRi—Ec—COMT，并通過(guò)煙草轉(zhuǎn)基因?qū)崿F(xiàn)功能驗(yàn)證，為低木質(zhì)素桉樹(shù)轉(zhuǎn)基因育種研究提供理論依據(jù)和物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　 獲得了以下主要結(jié)果：
　　 (1)桉樹(shù)CAD及COMT基因的RNA干擾片段的獲得。在已克隆的桉樹(shù)CAD、COMT全長(zhǎng)cDNA序列的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)特異引物，通過(guò)高保真擴(kuò)增技術(shù)克隆了桉樹(shù)CAD及COMT的正義、反義基因干擾片段，大小分別為：CAD550bp，COMT616bp。
　　 (2)桉樹(shù)CAD及C

3、OMT基因的RNA干擾載體構(gòu)建。采用現(xiàn)代分子生物學(xué)手段，以pRi35s與pCAMBIA2301作為橋梁載體，分別成功構(gòu)建了含有CaMV35S啟動(dòng)子、過(guò)氧化氫酶內(nèi)含子(catalase intron)及具有抗生素(Kan)選擇標(biāo)記基因的CAD及COMT基因的RNAi載體：pRi—Ec—CAD和pRi—Ec—COMT，并通過(guò)凍融法將其成功導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404中。
　　 (3)桉樹(shù)CAD及COMT基因的RNA干擾載體的煙草轉(zhuǎn)基因。

4、通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化技術(shù)，將RNAi載體pRi—Ec—CAD和pRi—Ec—COMT分別轉(zhuǎn)入到模式植物煙草中，并獲得了經(jīng)抗Kan篩選的RNAi片段的候選轉(zhuǎn)基因植株，對(duì)候選植株的基因組DNA進(jìn)行卡那霉素基因擴(kuò)增檢測(cè)，篩選出桉樹(shù)CAD及COMT基因RNA干擾載體導(dǎo)入的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因煙草植株。
　　 (4)桉樹(shù)CAD基因的RNA干擾效果分析。對(duì)不同時(shí)期生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)桉樹(shù)CAD基因干擾片段的煙草植株進(jìn)行表型觀察，與野生型煙草植株相比，轉(zhuǎn)基因

5、煙草植株的形態(tài)和生長(zhǎng)發(fā)育未見(jiàn)異常；對(duì)培養(yǎng)了6個(gè)月的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行Klason木質(zhì)素分析，與野生型煙草植株相比，轉(zhuǎn)基因煙草植株木質(zhì)素含量降低了12．3％～14．5％，表明桉樹(shù)CAD基因的RNA干擾載體在不影響煙草植株正常生長(zhǎng)發(fā)育情況下，能有效降低煙草植株的木質(zhì)素含量。
　　 (5)桉樹(shù)COMT基因的RNA干擾效果分析。對(duì)不同時(shí)期生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)桉樹(shù)COMT基因干擾片段的煙草植株進(jìn)行表型觀察，與野生型煙草植株相比，轉(zhuǎn)基因煙草植株在整個(gè)生長(zhǎng)時(shí)

6、期都表現(xiàn)出較大差異，葉片較大，植株矮小，莖段柔軟細(xì)小，易倒伏，生長(zhǎng)緩慢且成活率低；對(duì)培養(yǎng)了6個(gè)月的轉(zhuǎn)基因煙草植株進(jìn)行Klason木質(zhì)素分析，與野生型煙草植株相比，轉(zhuǎn)基因煙草植株木質(zhì)素含量分別降低2．4％～3．0％，結(jié)果表明，桉樹(shù)COMT基因的RNA干擾載體對(duì)煙草的木質(zhì)素下調(diào)效果不明顯，同時(shí)還影響轉(zhuǎn)基因煙草植株的正常生長(zhǎng)發(fā)育。
　　 上述轉(zhuǎn)基因煙草植株表型變化及抑制木質(zhì)素合成能力的結(jié)果初步表明，本文所構(gòu)建的桉樹(shù)CAD基因RNA干擾