二花臉豬卵泡形成和早期發(fā)育的特性及其相關通路的研究.pdf

1、卵巢卵泡發(fā)育包括啟始、募集、選擇、優(yōu)勢化、排卵和黃體化等環(huán)節(jié).該過程受激素,生長因子、金屬離子等多種因素控制,最終只有少數卵泡發(fā)育為優(yōu)勢卵泡并排卵,99％以上的卵泡發(fā)生閉鎖.太湖豬是我國四大著名地方豬種之一,二花臉豬是太湖豬的七大類群之一,以產仔率高、母性好、耐粗飼、肉質鮮美而聞名于世.雖然有關二花臉豬的繁殖特性觀察已見報道,但是與其繁殖相關的細胞生物學知識研究還很有限.
　　 原始卵泡庫的數量是決定雌性動物繁殖年限,卵母細胞的

2、數量決定著雌性哺乳動物的繁殖力.原始卵泡的形成過程也就是人們熟知的卵泡組裝,在組裝過程中,卵母細胞完成有絲分裂并進入減數分裂階段,原始卵泡就此形成.嚙齒動物卵泡的形成發(fā)生在出生后,而豬、牛、羊、和人類等動物的原始卵泡形成在出生前的胎兒時期.近年來的研究表明,類固醇激素、P13K/Akt和NO/sGC/cGMP等多條信號通路均在小鼠、大鼠、牛等動物的卵巢卵泡形成過程中發(fā)揮重要的調控作用.但是關于上述通路在豬的卵巢卵泡形成和早期發(fā)育過程中的

3、作用還鮮有報道.因此,深入研究豬卵巢細胞的生物學特性及相關信號通路在卵泡發(fā)育中的作用,對提高母豬繁殖力方面具有重要意義.
　　 本論文以二花臉豬為研究對象,重點研究了胎豬和新生仔豬卵巢卵泡發(fā)育的組織學變化,觀察到二花臉豬原始卵泡形成的時期和卵泡早期發(fā)育的關鍵階段；以免疫組織化學和化學發(fā)光法研究了胎兒和新生期豬卵巢組織中雌激素和孕激素含量變化對卵巢卵泡形成和早期發(fā)育的影響；以免疫組織化學和蛋白印跡方法研究了PTEN/PKB/FOX

4、O信號通路中相關蛋白在卵巢卵泡形成和早期發(fā)育中的表達；同時還對NOS信號通路的相關蛋白在卵巢卵泡形成和早期發(fā)育中的作用進行研究.
　　 1.二花臉豬卵巢卵泡形成與早期發(fā)育
　　 為了研究二花臉豬卵泡的形成和發(fā)育特點,取胎兒期50、70和90(日齡)、新生1日齡及生后期20、70和120(日齡)7個階段豬的卵巢組織樣進行組織學觀察.結果表明,生殖細胞在早期卵巢中以卵母細胞巢狀結構存在,原始卵泡最早出現在胎70日齡卵巢中,黃

5、體出現在生后120日齡；以Stat3為生殖細胞的標記蛋白,進行免疫組織化學觀察,統計出生前期各日齡階段卵母細胞巢和卵泡的比例.結果表明,從胎70日齡到胎90日齡,卵母細胞巢狀結構比例顯著降低,單個卵泡比例顯著增高,生后70日齡卵巢中出現有腔卵泡,未見黃體出現,生后120日齡卵巢中出現黃體；以PCNA作為細胞增殖的指標,進行卵巢組織的免疫組織化學定位,結果顯示,在豬的卵泡形成和早期發(fā)育階段以卵母細胞的快速增殖為主.說明二花臉豬的卵巢原始卵

6、泡開始形成的時間在胎豬70日齡左右,初情期在生后70～120日齡,卵泡激活前以卵母細胞的生長為主.
　　 2.豬卵巢卵泡早期發(fā)育過程中雌激素和孕激素含量變化及其受體的表達定位
　　 為了研究在豬卵巢卵泡形成和早期發(fā)育過程中卵巢組織雌激素和孕激素含量的變化,分析激素和卵泡形成與發(fā)育之間的關系,本試驗以胎豬和新生仔豬為試驗動物,通過免疫組織化學方法對胎豬和新生仔豬卵巢組織中的雌激素和孕激素受體進行定位,結果表明:在豬早期階段

7、卵巢中雌激素受體(ER)主要分布在卵巢表皮細胞、卵母細胞巢中的卵原細胞和卵母細胞以及原始卵泡、初級卵泡和次級卵泡的卵母細胞和顆粒細胞的核中；孕激素受體(PR)主要分布在卵巢表皮細胞、卵母細胞胞核以及原始卵泡和初級卵泡的顆粒細胞的核中；應用化學發(fā)光法對胎豬和新生仔豬的卵巢組織和血清中的雌激素及孕激素進行測定,結果表明:隨著胎齡的增加,卵巢勻漿液中的雌激素和孕激素水平下降.通過雌激素和孕激素水平與豬的卵泡形成的相關性分析,結果表明:卵巢組織

8、中的雌激素和孕激素含量與卵泡的形成和發(fā)育具有顯著的負相關.這預示出生前豬卵巢組織中的雌激素和孕激素含量變化可能影響豬卵巢卵泡的形成和早期發(fā)育.
　　 3.PTEN、PKB、FoxO3a和FoxO1蛋白在豬卵巢中的表達定位
　　 為了研究PTEN/PKB/FOXO信號通路在早期卵泡發(fā)育過程中的作用,本研究采用免疫組織化學方法對PTEN、PKB、FoxO1和FoxO3a蛋白在豬卵巢中的表達進行了細胞定位,結果表明:在胎兒和新

9、生期,PTEN、PKB、FoxO1和FoxO3a主要在卵母細胞巢中的卵原細胞、原始卵泡和初級卵泡的卵母細胞和血管內皮細胞的胞質等部位表達；在生后期,PTEN、PKB、FoxO1和FoxO3a,主要在腔前卵泡和有腔卵泡的顆粒細胞層、基底層、膜細胞層、黃體細胞和卵母細胞胞質中表達,其中FoxO1在顆粒細胞層的表達最為明顯.應用免疫蛋白印跡方法對PTEN、PKB和FoxO3a蛋白在胎豬卵巢中的表達進行了檢測分析,三種蛋白在胎豬卵巢中均有表達.

10、說明:PTEN/PKB/FOXO信號通路可能在卵泡的早期形成、生長和黃體化過程中具有調節(jié)作用.
　　 4.PTEN和FoxO3a蛋白在不同直徑豬卵泡顆粒細胞的表達
　　 為了研究PTEN和FoxO3a在不同卵泡顆粒細胞中的表達情況,本實驗用機械法從豬卵巢分離卵泡,按直徑大小分為2組:小卵泡(1.5～3 mm)和大卵泡(≧5 mm),分別統計健康卵泡比率,分離顆粒細胞并收集卵泡液.用臺酚藍排斥實驗檢測顆粒細胞的存活率,用W

11、estern blot檢測不同直徑卵泡顆粒細胞內FoxO3a、pAKT和PTEN表達水平,結果表明:隨卵泡直徑的增大,健康卵泡比率增加(P<0.05)；顆粒細胞存活率升高(P<0.05)；顆粒細胞內FoxO3a和PTEN表達水平升高(P<0.05),pAKT表達水平降低(P<0.05)；用化學發(fā)光法檢測不同直徑卵泡液中E2的濃度,結果表明:隨卵泡直徑的增大,卵泡液中E2的濃度升高(P<0.05).這預示著PTEN和FoxO3a蛋白在不同

12、直徑有腔卵泡顆粒細胞中的表達差異可能通過影響顆粒細胞生長和凋亡來調節(jié)卵泡發(fā)育與閉鎖.
　　 5.NOS和sGC蛋白在豬卵巢中的表達定位
　　 為了研究NO/sGC/cGMP信號通路相關蛋白在豬卵巢卵泡形成和發(fā)育過程中的作用,本實驗應用免疫組織化學方法對豬卵巢組織進行三種一氧化氮合酶(eNOS、iNOS和nNOs)和可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(sGCα1和sGCβ1)進行定位,結果表明:三種NOS在豬卵巢卵母細胞巢、各級卵泡卵母細

13、胞、卵巢表皮細胞,血管內皮細胞和黃體的胞質中均有表達.在生長卵泡和有腔卵泡的顆粒細胞層和膜細胞層也有表達,在顆粒細胞和膜細胞中的表達隨著卵泡的發(fā)育而逐漸增強；sGCα1和sGCβ1在卵巢的卵母細胞巢、原始卵泡及小的發(fā)育卵泡的顆粒細胞、血管內皮細胞中表達,在有腔卵泡的基膜細胞和黃體細胞中也有適度表達.此外,在90胎齡和新生1日齡卵巢組織中的原始卵泡和初級卵泡的顆粒細胞中的表達強度極高,而隨著卵泡尺寸的增大,其表達強度逐漸降低.卵巢中NOS

14、的活性測定結果表明:TNOS、eNOS和iNOS含量在出生前期顯著高于出生后期(p<0.05),nNOS含量在出生前期和出生后期之間差異不顯著(p>0.05).這表明NO/sGC/cGMP通路在卵泡的早期發(fā)育過程中發(fā)揮一定的作用.
　　 綜上所述,卵巢卵泡形成和早期發(fā)育是一個復雜的生理過程,多個因素在該過程中起作用.本試驗結果表明二花臉豬的卵巢原始卵泡是在胎兒期形成的,類固醇激素、PTEN/PI3K/Akt/FOXO和NO/'s