豬肌肉組織差異蛋白質組學研究.pdf

1、豬肉是肉類消費的重要組成部分,是人類獲得蛋白質營養(yǎng)物質的主要途徑之一,在國人飲食結構中占據絕對的比重；而豬不僅可作為肉產品的重要來源,還可作為模式器官動物。因此,深入探討豬骨骼肌生長發(fā)育的機制不僅對畜牧生產有重要意義,同時也為人類醫(yī)學研究提供重要補充。本研究通過建立的以雙向電泳和質譜為基礎的蛋白質組學分析平臺,開展豬肌肉組織蛋白質組學相關研究,系統(tǒng)分析了國內外典型品種(梅山豬與大白豬)及梅山豬不同發(fā)育時期骨骼肌的蛋白質組學差異,并就部分

2、差異蛋白在基因水平做了進一步的研究,以期為闡明豬肌肉品質形成的分子機制奠定了分子基礎。取得的主要研究結果如下:
　　 1.從不同的樣品處理、不同上樣量、不同pH IPG膠條的選擇、不同二向膠濃度、不同染色方法等方面對豬肌肉組織蛋白雙向電泳分離條件進行優(yōu)化,并就一些常見問題進行了詳細分析,從而建立了豬肌肉組織蛋白雙向電泳分離技術。結果顯示,對于豬肌肉組織樣品,采用液氮研磨+超聲破碎的策略比單純液氮研磨更合適,蛋白質溶解性更好,核酸

3、污染少,圖譜比較均勻清晰；18鋤pH4-7的膠條比pH3-10NL分離效果好；對于銀染18 cm pH4-7的膠條150μg上樣量比較適宜。與前人相比,采用本方法獲得圖譜的分辨率及重復性都有所提高。
　　 2.采用基于雙向電泳和質譜技術為基礎的蛋白質組學方法對純種大白豬和梅山豬背最長肌進行蛋白質組學分析。共發(fā)現25個差異表達蛋白點,梅山豬中高表達的10個,而大白豬中高表達的15個,其中20個蛋白點經MALDI-TOF-MS方法成

4、功鑒定,得到14個不同的蛋白,這些蛋白按功能可以分為4類:代謝相關蛋白,防御與應激相關蛋白,肌纖維結構相關蛋白,其他未歸類蛋白。此外,我們采用熒光定量PCR方法對其中7個差異表達蛋白做了mRNA水平上的表達分析,結果表明蛋白質水平和mRNA水平存在較理想的相關性。同時我們還分析了大白豬和梅山豬背最長肌肌球蛋白重鏈4種亞型(Ⅰ、ⅡA、ⅠB和ⅡX)在mRNA水平上的表達情況,結果顯示Ⅰ型纖維在兩品種間沒顯著差異(P>0.05),ⅡA和ⅡX在

5、梅山豬中顯著高表達(P<0.05),而ⅡB在大白豬中顯著高表達(P<0.05)。
　　 3.利用18cm pH4-7的膠條,第二向12.5％的SDS-PAGE對梅山豬背最長肌總蛋白進行2-DE分離,共得到36塊2-DE膠(4*3*3),采用軟件對圖像進行分析,經one-way ANOVA分析(P<0.01),共發(fā)現不同時期間差異表達蛋白點(>1.5倍)共99個,其中胚胎65天與出生后3天相比,有78個(下調27個,上調51個)；

6、出生后3天與60天相比,有70個(下調21個,上調49個)；出生后60天與120天相比,有40個(下調22個,上調18個)。經MALDI-TOF/MS質譜成功鑒定90個蛋白點,得到66個不同的蛋白,按功能分為8類:代謝相關蛋白為最大一類,占25％,包括糖酵解代謝相關酶、線粒體氧化代謝相關酶及其他代謝相關酶類,糖酵解代謝相關酶隨著肌肉的生長發(fā)育呈上調表達趨勢,而線粒體氧化代謝相關酶呈相反趨勢；第二大類為肌纖維調節(jié)相關蛋白,占19％,包括M

7、LC1sa、MLC1sb、MyBP-H、ACTN3、CapZ-β等；細胞骨架蛋白占11％,包括desmin、cofilin-1、FSCN1、gelsolin等7個,這些蛋白隨著肌肉的生長發(fā)育均呈下調表達趨勢；細胞防御相關蛋白占14％,包括HSP27、Hsp60、Hsp90、DJ1、TCP1等；信號轉導相關蛋白占6％；抗氧化與解毒相關蛋白8％；運輸蛋白6％；其他未歸類蛋白占11％。這些蛋白按細胞組成可分為6類,有43％的屬于胞漿蛋白,26

8、％的屬于細胞骨架蛋白,6％的屬于膜蛋白,11％的為線粒體蛋白,核蛋白占9％。用蛋白質組學數據與梅山豬背最長肌不同發(fā)育時期轉錄表達譜數據比較分析大部分基因在轉錄水平與翻譯水平存在較好的一致性,只是在翻譯水平由于存在翻譯后修飾,蛋白水平的更為復雜。此外,我們通過設計特意引物對梅山豬背最長肌不同發(fā)育時期的肌動蛋白重鏈的四種亞型進行熒光定量分析,發(fā)現在胚胎65天ⅡX和ⅡB型纖維已開始表達,但占比例很少,主要為Ⅰ型纖維(81.5％),而就整個發(fā)育

9、過程Ⅰ型纖維由胚胎65天的81.5％遞減到出生后120天的15.5％,Ⅱb型纖維卻由2.8％遞增到48.7％,四種肌纖維在豬肌肉發(fā)育過程中處于Ⅰ←→ⅠA←→ⅡX←→ⅡB相互轉換的動態(tài)平衡狀態(tài)。另外,我們采用Western Blot方法,選取AFP、vimentin、desmin和HSP90等4個蛋白進行驗證分析,發(fā)現結果與蛋白質組學數據較一致,進一步說明了我們2-DE和質譜結果的可靠性。
　　 4.選取ATP5B、ATP5A、1

10、4-3-3ζ等三個差異表達蛋白對應的基因,作了進一步的分析。組織表達譜顯示:ATP5B和ATP5A在睪丸、子宮、脂肪等組織相對高表達,心、睪丸、卵巢、小腸等組織次之,肌肉和肺中的表達相對較低,而在各組織中ATP5B的表達量均比ATP5A高；發(fā)現14-3-3ζ基因轉錄本1在脂肪中表達量最高,心臟、小腸和肌肉次之,肝臟、大腦、睪丸、卵巢中等表達,在腎臟和胃中表達量最低,轉錄本2相對于轉錄子1在各組織中表達豐度都很低,從兩個轉錄本在不同類型肌

11、肉表達分布來看,14-3-3ζ基因的肌纖維特異性似乎不明顯。不同時期發(fā)育表達譜顯示:ATP5B和ATP5A在3天和胚胎期高表達,生長后期表達量較低,而梅山中在大多數時期都比大白高；14-3-3ζ基因的兩個轉錄子在胚胎65天特異的高表達,這與差異蛋白質組學分析中的該基因蛋白水平表達是一致的,而不同時期品種間相比,兩個轉錄本在大白中的表達均高于梅山。多態(tài)性分析:ATP5B基因第八外顯子75處有-A/G突變,利用梅山豬和大白豬雜交組建的F2代