雙價基因轉化石斛蘭的研究.pdf

1、石斛蘭軟腐病的致病菌是胡蘿卜軟腐歐文氏菌，且其致病機理與自身的群感效應系統(tǒng)有關。蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，Bt)的aiiA基因編碼的AiiA蛋白通過降解致病菌群感效應系統(tǒng)中的信號分子來擾亂其群感效應從而達到防治石斛蘭軟腐病的效果；抗菌肽具有廣譜抗性，對于細菌、真菌、病毒、原核生物及癌細胞都有一定毒性，甚至可以直接殺死某些微生物，所以克隆自棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)的hacD基因

2、其編碼的抗菌肽也可以作為防治石斛蘭軟腐病的策略之一。本論文擬通過對aiiA基因與抗菌肽hacD基因的成熟片段進行原核表達，并分析這兩種蛋白的活性，然后將aiiA基因與抗菌肽hacD基因的成熟片段融合后，應用農桿菌介導的方法將此融合基因轉入石斛蘭，以期獲得抗軟腐病的石斛蘭植株。
　　 本研究通過PCR方法克隆了aiiA基因(來自Bacillus thuringiensis)和抗菌肽hacD基因的成熟肽片段(來自Helicoverp

3、a armigera)，將這兩個基因融合，hacD基因融合到aiiA基因的下游端，并在兩個基因的融合處引入Factor Xa的酶切位點，將融合基因克隆到原核表達載體pQE-30上并轉化大腸桿菌M15，經IPTG誘導，高效表達出了大小為34 kDa的融合蛋白。融合蛋白經非變性純化、脫鹽濃縮后，測定了其生物活性。對融合蛋白進行了活性分析，結果顯示只有經Factor Xa酶切釋放出來抗菌肽能夠抑制標準抗菌肽活性測試菌E.coli K12D31

4、的生長；對AiiA的活性進行了測定，結果表明融合蛋白經酶切后釋放出的AiiA蛋白及未經酶切的融合蛋白均保持了降解AHLs分子的能力；除此之外，胡蘿卜侵染實驗發(fā)現，經融合蛋白處理過的胡蘿卜軟腐歐文氏菌能夠減緩軟腐病癥。
　　 將aiiA基因和抗菌肽hacD基因的成熟肽片段融合后，克隆進包含有花椰菜花葉病毒35S(Cauliflower Mosaic Virus 35S promoter,CaMV 35S)啟動子、胭脂堿合成酶基因的