石斑魚虹彩病毒dUTPase及兩個囊膜蛋白的鑒定和功能初步分析.pdf

1、新加坡石斑魚虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus，SGIV)是從養(yǎng)殖的石斑魚中分離到的水產(chǎn)動物重要病毒病原。已經(jīng)對病毒的理化性質(zhì)，流行病學，全基因組信息等進行了比較系統(tǒng)的研究。本文不僅建立了赤點石斑魚的腎組織細胞系，并在分子水平對SGIV編碼的dUTPase及兩個外膜蛋白進行鑒定和功能初步分析，為研究病毒的致病機理提供技術平臺和理論依據(jù)。主要結(jié)果描述如下：
　　 1、采用組織消化法建立了赤點石斑魚腎

2、組織細胞系(EAGK)，通過顯微鏡觀察，細胞計數(shù)、染色體分型和細胞轉(zhuǎn)染等分析了傳代細胞系的特征。EAGK細胞可以在含10％FBS的L15培養(yǎng)基中保持良好的生長趨勢，培養(yǎng)的適合溫度在25-30℃；染色體數(shù)目82條。細胞轉(zhuǎn)染實驗證明，CMV和SV40啟動子可以啟動外源轉(zhuǎn)染基因在細胞內(nèi)的高效表達。此外，通過顯微和超微觀察、病毒滴度測定等方法證實EAGK細胞對SGIV敏感。以上結(jié)果揭示新建的EAGK細胞不僅能夠用于體外遺傳操作，而且可以用于水生

3、動物病毒分離鑒定、病毒致病機理、功能基因及病毒與宿主相互作用的研究。
　　 2、通過同源性搜索和生物信息學分析表明：SGⅣ ORF049R編碼一個尿密啶脫氧核糖核苷三磷酸酶(dUTPase)；在其氨基酸序列近C-端存在一段核輸出信號(nuclear export signal，NES)。為深入研究SGⅣ編碼的dUTPase在病毒感染過程中的作用，對SGⅣ編碼的dUTPase基因進行了克隆、表達、轉(zhuǎn)錄時序分析及亞細胞定位等特征分析

4、。RT-PCR和Western Blot的結(jié)果證實，該基因是一個病毒早期轉(zhuǎn)錄本，屬于立即早期基因。通過真核轉(zhuǎn)染和熒光顯微鏡觀察，顯示該酶是一個胞質(zhì)型蛋白，分布在細胞核外的胞質(zhì)區(qū)。同時，我們對NES片段進行Overlapping PCR缺失，發(fā)現(xiàn)NES缺失后，SGⅣ dUTPase無法正常輸出細胞核，證明NES序列對SGⅣ dUTPase輸出細胞核起決定性作用。這是首次在dUTPase家族中發(fā)現(xiàn)NES介導的核輸出轉(zhuǎn)運機制，將對進一步了解病

5、毒基因在SGIV感染細胞中精細的亞細胞水平調(diào)控具有重要的指導意義。
　　 3、病毒的外囊膜蛋白在病毒感染、復制及致病過程中起重要作用。參照以往報道的分離囊膜蛋白的方法，我們改進了一種新的分離SGⅣ外囊膜的方法。不僅可以方便快捷的分離病毒外囊膜和外膜蛋白，同時對病毒衣殼組分沒有明顯破壞。利用這種方法，我們分離了SGⅣ的兩個外囊膜蛋白：VP19和VP75。分別對兩個基因進行克隆、表達和抗體制備后，通過免疫電鏡技術證實VP19和VP7

6、5是病毒的外囊膜蛋白。藥物抑制實驗顯示，AraC可以抑制VP19和MCP的表達，證明VP19和MCP一樣，是SGⅣ的晚期轉(zhuǎn)錄本，與ATV和RGV的VP19同系物相同。亞細胞定位結(jié)果顯示，VP19呈現(xiàn)與病毒加工廠共定的位特征；VP75則分布在病毒加工廠外?？贵w中和實驗顯示，VP19抗體對病毒入侵具有強烈的抑制作用，VP75抗體對病毒入侵有一定的抑制作用，證明VP19和VP75可能在病毒入侵階段發(fā)揮重要作用。
　　 本研究中新建的細