高繁殖力黃淮山羊類固醇激素分泌特點與卵泡顆粒細胞基因差異表達的研究.pdf

1、本文調(diào)查了黃準山羊高繁殖力母羊不同胎次與產(chǎn)羔數(shù)之間的關(guān)系，比較了高低繁殖力母羊在發(fā)情周期和卵巢摘除初期外周血P4和E2變化的特點，探討了不同繁殖性狀母羊在黃體期早期的卵泡、黃體及其卵泡閉鎖的差異。通過抑制消減雜交技術(shù)建立起了高繁殖力母羊卵泡發(fā)育顆粒細胞差異表達基因消減cDNA文庫，旨在揭示高繁殖力母羊卵泡發(fā)育調(diào)控及生殖內(nèi)分泌特點，為進一步研究高繁殖力母羊的遺傳育種提供一定的參考依據(jù)。
　　 1黃淮山羊高繁殖力母羊產(chǎn)羔調(diào)查與分析<

2、br>　　 為了探究高繁殖力母羊多胎繁殖性狀的特點，對江淮地區(qū)427只具有高繁殖力黃淮山羊母羊（窩產(chǎn)羔數(shù)至少一次產(chǎn)羔≧5）的產(chǎn)羔進行了調(diào)查和分析。結(jié)果表明，隨著胎次的增加，高繁殖力母羊的產(chǎn)羔數(shù)增加，直至第5胎次，之后產(chǎn)羔數(shù)下降。在所有胎次中，高繁殖力母羊在第5胎次的產(chǎn)羔數(shù)達到最大，平均窩產(chǎn)羔數(shù)3.78-0.06羔，與其他胎次的產(chǎn)羔數(shù)相比較，呈極顯著差異；相比之下，母羊在第1胎次的產(chǎn)羔數(shù)極顯著低于其他胎次。根據(jù)不同窩產(chǎn)羔數(shù)的母羊所占比例

3、分析，在第1胎次，隨窩產(chǎn)羔數(shù)的增加，其母羊的比例依次降低，但在之后母羊所占的比例中，窩產(chǎn)l羔和2羔的比例急劇下降；而窩產(chǎn)4～7羔的母羊比例呈遞增趨勢延至第4～5胎次，其中隨著窩產(chǎn)羔數(shù)的增加，其母羊所占比例的最大值在不同胎次間的分布依次后移。以上結(jié)果提示，高繁殖力母羊的多胎性狀在不同胎次間具有明顯的差異，其母羊性成熟后在初次繁殖時卵巢卵泡成熟與排卵及其妊振生理等已經(jīng)具備了極端高繁殖力的生理特點。
　　 2在發(fā)情周期中高低繁殖力母羊

4、外周血孕酮和雌二醇濃度變化的比較選擇生殖機能正常、空懷、經(jīng)產(chǎn)的黃淮山羊高繁殖力(窩產(chǎn)羔數(shù)至少一次產(chǎn)羔≧5)和低繁殖力（每次窩產(chǎn)羔數(shù)≦2）母羊各4只。以間隔12d肌注氯前列烯醇0.1mg/只·次誘導(dǎo)同期發(fā)情后，在自然發(fā)情周期中，連續(xù)兩個情期每天以間隔12h和在黃體中期和發(fā)情前期間隔12min密集性采集頸靜脈瘺管血樣，測定外周血E2和P4含量。結(jié)果顯示，在黃體期的大多數(shù)時間內(nèi)，高繁殖力母羊外周血P4量高于低繁殖力母羊，在黃體期早期的P4量上

5、升速度，高繁殖力羊早于低繁殖力羊；兩組母羊在P4的平臺期，P4量呈顯著性差異。在整個發(fā)情周期中，高繁殖力母羊平均E2濃度均高于低繁殖力母羊；在黃體期早期，高繁殖力母羊出現(xiàn)2個E2峰值，而低繁殖力母羊僅有1個。高低繁殖力母羊外周血P4和E2的量均是以非典型的脈沖式變化。以上結(jié)果表明，在黃體期早期，高繁殖力母羊外周血P4量的上升速度和卵泡波卵泡發(fā)育的周轉(zhuǎn)均高于低繁殖力母羊，而在E2含量上，高繁殖力母羊維持在較高水平。
　　 3高低繁

6、殖力母羊在黃體期早期卵巢卵泡和黃體的比較
　　 高低繁殖力母羊各4只，在氯前列烯醇同期發(fā)情后的第3個發(fā)情周期7～9d，通過頸靜脈瘺管采集羊的外周血液，測定E2和P4含量，并于第7和第9d應(yīng)用羊用腹腔內(nèi)窺鏡和腹部手術(shù)方法，觀察和測定母羊卵泡和黃體大小。結(jié)果顯示，在發(fā)情周期7～9d的卵泡發(fā)育中，高低繁殖力母羊卵巢小卵泡和大卵泡數(shù)均處于減少趨勢中，但差異均不顯著，而中卵泡數(shù)以及總卵泡數(shù)均增加，其中高繁殖力母羊的中卵泡數(shù)平均增加了7.5

7、0個/只，低繁殖力母羊平均增加了4.80個/只。高繁殖力母羊外周血P4和E2濃度分別高于低繁殖力母羊，P4濃度在高低繁殖力母羊之間呈顯著性差異；在發(fā)情周期第9d，高繁殖力母羊卵巢小卵泡數(shù)和Ⅱ型黃體數(shù)均分別顯著高于低繁殖力羊16.43％和27.73％。以上結(jié)果表明，在發(fā)情周期7～9d的卵泡發(fā)育中，黃淮山羊高低繁殖力母羊卵巢小卵泡、中卵泡和大卵泡數(shù)的發(fā)育趨勢基本處于相同的生理變化。高繁殖力母羊外周血P4濃度顯著高于低繁殖力母羊，促進了高繁殖

8、力母羊卵泡的周轉(zhuǎn)；高繁殖力母羊排卵卵泡以體積相對較小的成熟卵泡增多，卵巢卵泡的共優(yōu)勢化明顯，Ⅱ型黃體數(shù)增加。
　　 4卵巢摘除初期高低繁殖力母羊外周血孕酮和雌二醇濃度變化的比較
　　 高低繁殖力母羊各4只，在發(fā)情周期的第9d，通過腹部外科手術(shù)摘除雙側(cè)卵巢，并應(yīng)用頸靜脈瘺管連續(xù)5d和卵巢摘除后第1和第5d密集性采血。結(jié)果顯示，母羊卵巢在摘除后的E2和P4分泌，均以非典型性的脈沖式釋放。在卵巢摘除后的第ld，高繁殖力母羊外周

9、血液P4和E2濃度均分別大于低繁殖力母羊。高低繁殖力母羊在卵巢去除后的1～3d的P4水平均呈下降趨勢；高繁殖力母羊的E2除在第ld極顯著性高于低繁殖力羊外，在其后的2～5d，E2的平均值總體呈低于低繁殖力母羊的趨勢，并在第5d呈現(xiàn)差著性差異。以上結(jié)果表明，母羊非性腺相關(guān)組織在分泌E2和P4時呈現(xiàn)非典型的脈沖式。在外周血E2量上，高低繁殖力母羊之間存在呈現(xiàn)顯著性差異，非性腺組織所產(chǎn)生的E2可能參與了母羊的生殖過程。
　　 5山羊黃

10、體期閉鎖卵泡的組織定位觀察
　　 高低繁殖力母羊各4只，在發(fā)情周期第9d通過腹部外科手術(shù)摘除雙側(cè)卵巢，迅即投入液氮中保存，冷凍切片，TUNEL檢測法結(jié)合蘇木精染色法，觀察卵巢閉鎖卵泡的組織學(xué)特點。結(jié)果顯示，在高低繁殖力母羊卵巢閉鎖的無腔卵泡中，均極少見到凋亡的卵母細胞。有腔卵泡的閉鎖，多表現(xiàn)在卵泡腔的壁顆粒細胞層中有大量顆粒細胞凋亡，表現(xiàn)出明顯的熒光反應(yīng)，并多處于近腔顆粒細胞；而部分卵泡在顆粒層中出現(xiàn)凋亡細胞偶有零星存在的現(xiàn)象，

11、但是在高低繁殖力母羊之間均無明顯差異。在高繁殖力母羊的卵巢中，僅一膜之隔的相鄰卵泡之間閉鎖和非閉鎖同時顯現(xiàn)。以上結(jié)果表明，TUNEL檢測結(jié)合原片蘇木精染色的鑒定為卵巢組織凋亡細胞的定位提供一個較好的方法。在閉鎖的有腔卵泡中，卵泡多表現(xiàn)出近腔細胞的凋亡特征，高低繁殖力母羊在閉鎖卵泡的組織定位上無顯著性差異。
　　 6高繁殖力母羊大小卵泡顆粒細胞差異表達基因消減cDNA文庫的構(gòu)建和篩選
　　 以氯前列烯醇肌肉注射2只高繁殖力

12、母羊40h后剪取卵巢，在20min內(nèi)計數(shù)卵泡、測量卵泡直徑，以組織鈍性分離和收集顆粒細胞，并剪取取樣后的卵泡部分組織置入液氮內(nèi)保存。從顆粒細胞中提取總RNA的大卵泡(5～6 mm)和小卵泡(3～4 mm)均未發(fā)生凋亡，總RNA經(jīng)過雙鏈cDNA的合成和擴增，以抑制消減雜交技術(shù)(SSH)構(gòu)建了山羊卵泡顆粒細胞正向和反向cDNA文庫。在正反向文庫中，分別隨機挑選了190個克隆進行斑點雜交。根據(jù)斑點雜交信息，在正反向文庫中共選擇了110個克隆單