牡丹PsMPT基因啟動(dòng)子系列缺失表達(dá)載體及花芽酵母雜交文庫構(gòu)建.pdf

1、牡丹（PaeoniasuffruticosaAndr.）是原產(chǎn)我國的特有名貴花卉，譽(yù)稱“國色天香”、“花中之王”。春節(jié)催花是牡丹產(chǎn)業(yè)主要內(nèi)容之一，生產(chǎn)中催花不良甚至催花失敗的現(xiàn)象常有發(fā)生。理解休眠解除調(diào)控機(jī)理是完善催花技術(shù)、解決生產(chǎn)中存在問題的理論基礎(chǔ)?，F(xiàn)已證明，PsMPT(線粒體磷酸轉(zhuǎn)移子)基因在低溫解除牡丹休眠中的能量代謝中發(fā)揮了重要作用。闡明PsMPT基因在低溫解除休眠中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，對(duì)深入理解低溫解除休眠的調(diào)控機(jī)制具有重要意義

2、。本研究擬克隆PsMPT基因啟動(dòng)子，構(gòu)建其系列缺失表達(dá)載體和休眠牡丹花芽酵母雜交文庫，為篩選啟動(dòng)子中的低溫響應(yīng)元件、并通過酵母單雜交技術(shù)篩選低溫調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而為闡明PsMPT基因的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)選用山東菏澤牡丹基地4年生牡丹品種‘魯荷紅'（PaeoniasuffruticosaAndr.'LuHeHong'）的健壯植株，以CTAB法提取其基因組DNA，通過TAIL-PCR(熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR)技術(shù)擴(kuò)增PsMPT基因啟動(dòng)子，進(jìn)

3、一步構(gòu)建系列缺失啟動(dòng)子表達(dá)載體，并構(gòu)建了休眠花芽酵母雜交AD(轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域)文庫。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　 1.設(shè)計(jì)了3個(gè)特異引物SP1、SP2和SP3，利用TAIL-PCR技術(shù)擴(kuò)增出約1kb的啟動(dòng)子片段。將得到的啟動(dòng)子片段連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)PCR和HindⅢ/BamHⅠ雙酶切鑒定，證明克隆片段已經(jīng)插入pMD18-T載體。測(cè)定了該克隆片段序列，并進(jìn)一步根據(jù)全長序列設(shè)計(jì)了上游引物SP4，與下游引物SP1

4、組合驗(yàn)證了克隆的啟動(dòng)子。
　　 2.序列分析表明該啟動(dòng)子片段含有1177個(gè)核苷酸。經(jīng)PLACE和PlantCare分析，發(fā)現(xiàn)序列中包含啟動(dòng)子的一般結(jié)構(gòu)TATA-box和CAAT-box，序列分析還發(fā)現(xiàn)幾個(gè)GATA-box，其核心序列為GATA;1個(gè)低溫響應(yīng)元件LTRE(lowtemperatureresponsiveelement)，其核心序列為CCGAC。另外，還發(fā)現(xiàn)了8個(gè)脫水響應(yīng)元件MYC(雙鏈)，其核心序列為CANNTG(

5、N=A/T/G/C)。MYC調(diào)控CBF/DREB1在低溫條件下的轉(zhuǎn)錄，推測(cè)該功能元件可能與低溫響應(yīng)有關(guān)。
　　 3.根據(jù)啟動(dòng)子分析工具所獲得的MYC元件的位置，在得到的啟動(dòng)子序列上游設(shè)計(jì)5條上游引物，分別與下游的1條共同引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到含有MYC元件的5個(gè)長度不同的片段，片段長度分別為322bp，582bp，726bp,844bp和1176bp。
　　 4.將5個(gè)片段連接到pBI121載體替代其中的CaMV35S

6、啟動(dòng)子，構(gòu)建了系列缺失啟動(dòng)子，為進(jìn)一步鑒定其中的低溫響應(yīng)元件，進(jìn)而為篩選調(diào)控PsMPT基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子奠定了基礎(chǔ)。
　　 5.從低溫處理0、7、14、21、28d的牡丹花芽中提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后利用LD-PCR合成了雙鏈cDNA。經(jīng)檢測(cè)，提取的總RNA質(zhì)量好，無降解現(xiàn)象。
　　 6.經(jīng)CHROMASPINTMTE-400柱純化后，重組pGADT7-Rec質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌株AH109，構(gòu)建了酵母雜交文庫，文庫滴度為1.77