刺參(Apostichopus japonicus)體腔細胞原代培養(yǎng)技術的建立及其在快速篩選免疫增強劑中的應用.pdf

1、本文以我國重要的海水養(yǎng)殖動物刺參(Apostichopus japonicus)為研究對象，探索了刺參體腔細胞的體外原代培養(yǎng)技術，并用細菌細胞壁的主要成分脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)對離體培養(yǎng)條件下的刺參體腔細胞進行刺激，通過檢測細胞一系列免疫酶活性，和吞噬能力，呼吸爆發(fā)等免疫指標的變化，建立了刺參體腔細胞免疫能力的評價方法。然后使用潛在的免疫增強物質(zhì)殼寡糖(chitooligosaccharide，COS)體

2、外刺激體腔細胞，證明了殼寡糖對刺參體腔細胞具有免疫促進效果。養(yǎng)殖實驗證明殼寡糖也能夠在個體水平上有效地提高刺參的免疫能力，提示殼寡糖可作為一種新型的刺參免疫增強劑進行開發(fā)。同時證實了體內(nèi)體外實驗的結(jié)果有良好的一致性，為將來在體外高通量大規(guī)模地篩選刺參免疫增強劑打下了基礎。主要研究結(jié)果如下： 1.使用營養(yǎng)成分由低到高的三種培養(yǎng)液，CCM(成分為0.5 MNaCl，5 mMMgCl2，1 mM EGTA，20 mM HEPES，葡萄

3、糖0.6g/l，1g/l蛋白胨，50 units/ml青霉素，50μg/ml鏈霉素，pH7.6)，HSM[成分為31 g/lNaCl，10 mM Hepes，10 mg/l酚紅，10％(vol/vol)Minimum EssentialMedium(MEM)，1 g/l蛋白胨，50 units/ml青霉素，50μg/ml鏈霉素，pH7.6]，L-15-N(主要成分為Leibovitz'S L-15細胞培養(yǎng)液，補充加入23 g/l NaC

4、l，青鏈抗生素和硫酸慶大霉素50μg/ml，pH7.6)，對刺參的體腔細胞進行了體外培養(yǎng)，并使用MTT還原方法對細胞在體外的存活力進行了測定。結(jié)果顯示，以CCM和HSM培養(yǎng)液培養(yǎng)的體腔細胞，在體外2日和5日后細胞活性明顯下降。L-15N培養(yǎng)液則能夠維持細胞活性，1周內(nèi)保持穩(wěn)定。重點觀察并記錄了刺參6類體腔細胞的兩種主要免疫細胞，球狀細胞和吞噬細胞的形態(tài)。刺參體腔液的滲透壓等同于其生活的海水，然而其PH值略低于海水。發(fā)現(xiàn)刺參體腔液中存在著

5、細菌。本實驗結(jié)果可為以后開展其他棘皮動物的體腔細胞體外培養(yǎng)工作提供技術指導，即1，弄清體腔液的各種理化因子和特性，2，滿足體腔細胞的營養(yǎng)需求。 2.使用脂多糖對體外原代培養(yǎng)的刺參體腔細胞進行免疫刺激。脂多糖刺激濃度為0，0.5，5，20μg/ml，分別于刺激后1 h，3 h，6 h，12 h，18 h，24 h，48 h取樣，測定了細胞中3種免疫酶，酸性磷酸酶(ACP)，總一氧化氮合酶(T-NOS)，超氧化物歧化酶(T-SOD)

6、，和吞噬指數(shù)，呼吸爆發(fā)的活性變化情況。實驗結(jié)果顯示，脂多糖的刺激，顯著提高了細胞的吞噬指數(shù)，呼吸爆發(fā)和T-NOS，T-SOD兩種酶的活性(P＜0.05)，但卻對ACP的活性變化幾乎沒有影響。雙因素方差分析顯示海參體腔細胞的T-NOS和呼吸爆發(fā)同時受到脂多糖處理時間的影響，并且脂多糖刺激濃度和處理時間之間存在著顯著的相互作用(P＜0.05)。因此，T-NOS，T-SOD，呼吸爆發(fā)和吞噬活性，這四個指標均可作為衡量在體外原代培養(yǎng)的刺參體腔細

7、胞免疫狀況的敏感免疫指標。建立了刺參體腔細胞的免疫評價方法，為在體外應用細胞培養(yǎng)技術，快速驗證潛在的免疫增強劑對刺參體腔細胞的免疫提升效果，并最終開展實際養(yǎng)殖實驗奠定了基礎。 3.使用殼寡糖對體外原代培養(yǎng)的刺參體腔細胞進行免疫刺激。殼寡糖刺激濃度為0，40，60，80，120μg/ml分別于刺激后1 h，3 h，6 h，12 h，24 h取樣，測定了細胞中3種免疫酶，酸性磷酸酶(ACP)，總一氧化氮合酶(T-NOS)，超氧化物歧

8、化酶(T-SOD)，和吞噬指數(shù)，呼吸爆發(fā)的活性變化情況。實驗結(jié)果顯示，殼寡糖的刺激，均在不同程度上顯著提升了細胞的吞噬指數(shù)，呼吸爆發(fā)和T-NOS，T-SOD，ACP三種免疫酶的活性(P＜0.05)。殼寡糖能夠在體外顯著提升刺參主要免疫細胞體腔細胞的免疫力，提示其可能可以作為一種新型的免疫增強劑，應用到刺參的實際養(yǎng)殖實驗中去。 4.研究了在飼料中添加殼寡糖對刺參生長和免疫狀況的影響。殼寡糖的添加量分別為0(對照)，100 mg/k

9、g(低濃度)，250 mg/kg(中濃度)，600 mg/kg(高濃度)。每處理3個重復。刺參起始體重為7.9±0.02 g，室內(nèi)靜水充氣養(yǎng)殖，以25個/桶的密度飼養(yǎng)于70-L的水桶中。每日傍晚吸底清污一次并投喂稍微過量的飼料，飼養(yǎng)8周。結(jié)果表明當飼料中添加600mg/kg的殼寡糖時刺參的增重率，體腔細胞密度和總一氧化氮合酶水平顯著高于對照組和中、低添加量組(P＜0.05)。飼料中添加殼寡糖能顯著提高刺參體腔細胞的呼吸爆發(fā)活力，而且中、

10、高濃度的殼寡糖(250和600 mg/kg)顯著提高了刺參體腔細胞的吞噬活性和超氧化物歧化酶水平(P＜0.05)。飼料中添加殼寡糖對刺參體腔細胞內(nèi)酸性磷酸酶活性并無顯著影響；攻毒實驗表明，添加高濃度600 mg/kg的殼寡糖可以顯著降低燦爛弧菌(Vibro splendiclus)對刺參的累計死亡率，而中、低添加量組與對照無顯著差異。綜上所述，為提高刺參的免疫力和促進生長，飼料中殼寡糖的適宜添加量為600 mg/kg。殼寡糖在體外和體內(nèi)

11、兩種條件下均能有效地提升刺參體腔細胞和個體水平的免疫能力。 結(jié)論：實驗初步證實了，借助原代培養(yǎng)的刺參體腔細胞這個平臺，在體外篩選刺參用免疫增強劑是可行的。用脂多糖建立了體腔細胞的免疫評價方法，對潛在的免疫增強物質(zhì)殼寡糖進行了快速篩選，驗證了其對體腔細胞的免疫促進效果。養(yǎng)殖實驗顯示殼寡糖也能夠在個體水平上有效地提高刺參的免疫能力，證實了體內(nèi)體外實驗的結(jié)果有良好的一致性。這樣，在體外經(jīng)濟快速地篩選刺參免疫增強劑，加快高效免疫增強劑的