六種植物病毒Real Time PCR定量方法的建立及其應用.pdf

1、植物病毒的檢測是植物病毒病監(jiān)測防控中最為重要的環(huán)節(jié)之一。以往常規(guī)的血清學檢測，核酸雜交檢測和傳統(tǒng)PCR技術在植物病毒檢測應用方面都或多或少存在著不完善的地方。因此，本研究以熒光定量PCR技術為基礎，錨定水稻條紋病毒(Ricestripevirus，RSV)、三種大麥黃矮病毒(Barelyyellowdwarfviruses，BYDVs)、小麥矮縮病毒(Wheatdwarfvirus，WDV)和黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumbergree

2、nmottlemosaicvirus，CGMMV)的CP序列基因保守區(qū)域，分別建立了各自的用于定量檢測的RealTimePCR方法。同時，應用這些方法對這幾種病毒進行了初步的定量檢測研究。主要內容如下： 1.建立了一套用于定量檢測RSV的OneStepRealTimeRT-PCR方法。通過序列比對，在RSVCP序列保守區(qū)域內設計特異性的引物和探針；通過在GenBank中用BLAST進行比對，證實引物探針特異性很高。對RSVOne

3、StepRealTimeRT-PCR反應體系進行優(yōu)化，最佳的引物和探針終濃度均為O.2μmol/L建立標準曲線，檢測靈敏度可達到20拷貝/2μl體系，曲線斜率和擴增效率均符合定量要求。通過與ELISA檢測技術的靈敏度對比，該實時熒光定量PCR方法展現(xiàn)出極高的靈敏性。對感RSV水稻不同組織內和單頭帶毒灰飛虱體內RSVCPRNA進行絕對定量檢測。結果顯示，水稻葉片中病毒RNA含量高于莖組織；雌蟲灰飛虱體內較雄蟲攜帶有更多的病毒RNA，并且蟲

4、體的胸腹部是病毒RNA最主要的聚集區(qū)，而蟲體頭部病毒RNA含量極低。 2.針對BYDVGPV、GAV和PAV的定量檢測，分別建立了OneStepRealTimeRT-PCR方法。三套獨立的檢測體系檢測靶基因序列均位于BYDVCP保守序列上。GPV檢測探針標記FAM熒光基團，GAV檢測探針標記CY5熒光基團，PAV檢測探針標記HEX熒光基團。建立標準曲線，三套定量檢測體系的檢測靈敏度均可以達到50拷貝/20μl體系，曲線斜率和擴增

5、效率均符合定量要求。通過對感病小麥的檢測證明所建立的RealTimePCR體系是成功的。 3.建立了一套用于定量檢測WDV小麥株系的RealTimePCR方法。通過序列比對，分別在WDV小麥株系CP基因和長非編碼區(qū)設計了兩組引物探針。其中錨定長非編碼區(qū)的引物和探針組合可以很好的區(qū)分WDV小麥株系和大麥株系。使用錨定CP基因的引物探針組合建立RealTimePCR定量檢測方法。通過對反應體系進行優(yōu)化，最佳的引物和探針終濃度均為0.

6、2μmol/L。建立標準曲線，檢測靈敏度可達到30拷貝/20μl體系，曲線斜率和擴增效率均符合定量要求。通過與ELISA檢測技術的靈敏度對比，該實時熒光定量PCR方法展現(xiàn)出比ELISA檢測要高的多的靈敏性。通過對田間采集的26組疑似WDV侵染小麥樣品進行定量檢測，其中24組樣品檢測為陽性，病毒檢出率為92.3％。而同時采用傳統(tǒng)普通PCR進行檢測，僅有12組樣品檢測為陽性，病毒檢出率不到50％。由此可見，本研究中所建立的熒光定量檢測方法相

7、對于傳統(tǒng)PCR檢測具有更高的靈敏度。對采集自病區(qū)的單頭條沙葉蟬體內WDV進行絕對定量，結果顯示該定量方法適合于單頭介體昆蟲帶毒量的檢測；進而為小麥產(chǎn)區(qū)WDV介體昆蟲帶毒率分析提供了一種新穎的，靈敏的，準確的手段。使用第二組引物探針，針對本實驗室采集的大麥樣品進行WDV小麥株系的檢測。結果顯示，樣品YNKM-29，YNKM-38，YNKM-39和YNKM-43可以檢測到WDV小麥株系DNA。 4.建立了一套用于定量檢測CGMMV的

8、OneStepRealTimeRT-PCR方法，并首次將檢測靶基因錨定于病毒CP基因上。通過摸索改進，建立了一套比較適合提取富含多糖多酚植物樣品總RNA的方法。對反應體系進行優(yōu)化，最佳的引物和探針終濃度均為0.2μmol/L。建立標準曲線，檢測靈敏度可達到50拷貝/20μl體系，曲線斜率和擴增效率均符合定量要求。利用建立的定量方法對西瓜種子不同部位組織帶毒量進行了檢測。結果顯示，子葉組織中病毒RNA含量極高，外種皮次之，內種皮最低。由此