轉cry8Ca基因煙草抗蠐螬活性的評價.pdf

1、金龜子幼蟲（蠐螬）是一類世界性的重要地下害蟲，由于這類害蟲為害植物地下部分，具有一定的隱蔽性，而且分布廣泛，為害植物種類多，對農林生產造成了極為嚴重的損失。蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis）HBF-1菌株含有cry8Ca基因，產生的殺蟲晶體蛋白對麗金龜科的黃褐麗金龜(Anomola exoleta)和銅綠麗金龜（A.Corpulenta）具有很高的殺蟲活性，目前已經將cry8Ca基因轉化到煙草中，獲得了轉基因煙草

2、植株。本項研究采用RNA斑點分析和酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）測定法檢測了cry8Ca基因在T1代轉基因煙草中的表達，并采用生物學方法評價了T1代轉基因煙草抗蠐螬的活性，建立了cry8Ca基因在煙草中表達的檢測方法及抗蠐螬活性的生物測定體系，為今后研究評價抗蠐螬轉基因植物提供了依據。
　　 本項研究對供試的110株T1代轉cry8Ca基因煙草進行DNA-PCR檢測,31株轉pSmCN載體的煙草植株為陽性。采用隨機引物法，通過地

3、高辛標記目的DNA片段制備探針，提取植株的RNA，進行RNA斑點雜交，結果表明外源殺蟲蛋白基因已經轉入煙草中，并在煙草植株中遺傳表達。
　　 酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）測定法廣泛應用于轉基因植物表達的殺蟲蛋白的檢測。本項研究采用過碘酸鈉法，將純化的Cry8Ca殺蟲蛋白的多克隆抗體用辣根過氧化物酶標記，獲得酶標抗體結合物，經過對各反應條件的優(yōu)化，確定了雙抗夾心ELISA方法檢測煙草中Cry8Ca殺蟲蛋白的最適體系：多克隆抗體濃

4、度為1:3200，酶標結合物濃度為1:400，pH9.6碳酸緩沖液提取，pH7.4磷酸緩沖液包被，0.5％明膠-PBST封閉，TMB底物作用15 min。采用該檢測體系檢測T1代轉基因煙草植株根部Cry8Ca蛋白的表達，結果表明，Cry8C蛋白含量最高可達14.461μg/g鮮重，占總蛋白量的0.057％。在組成型表達載體（pSmCN）的煙草植株中，不同的部位蛋白表達量不同，營養(yǎng)器官的含量高于生殖器官，根部的蛋白表達量顯著高于莖基部和葉

5、部。
　　 通過室內飼養(yǎng)研究，采用天然飼料飼喂銅綠麗和黃褐麗金龜的成蟲和幼蟲，明確了室內銅綠麗金龜種群完成一個生活史平均需要272.3d，比田間種群縮短約103.8d，。黃褐麗金龜種群在室內完成一個生活史平均需要230天。確定在壤土中接入金龜子的卵為轉基因煙草對蠐螬抗蟲性測定的最佳條件。
　　 將煙草地下根部受害程度分別設立五個危害等級，通過危害等級的評定，計算出危害指數。黃褐麗金龜和銅綠麗金龜幼蟲對供試的T1代陽性轉p