家蠶BmMet基因的鑒定、克隆及功能分析.pdf

1、在昆蟲的生長、變態(tài)和生殖等發(fā)育過程中，蛻皮激素(Molting hormone，MH)和保幼激素(Juvenile hormone，JH)發(fā)揮了重要的調控作用。目前，MH調控昆蟲生長發(fā)育的分子機制已經比較清楚，參與MH信號傳導的受體和其他級聯(lián)調控因子相繼被鑒定，并建立了MH的級聯(lián)信號傳導網絡。而有關JH的分子作用機制的研究報道則相對較少，參與JH信號傳導的關鍵調控基因至今還未被確定。 Methoprene-tolerant(M

2、et)基因最早在果蠅中被發(fā)現(xiàn)，編碼一個bHLH-PAS型轉錄因子，具有典型的DNA結合結構域。已有研究報道，DmMet可以與JH主要種類即JHIII特異性結合并具有很高的親和力，其突變體對JH產生抗性，過量表達DmMet則會增加果蠅對外源JH的敏感性，且能導致果蠅在幼蟲期和蛹期死亡。另外，通過RNAi的方式將赤擬谷盜TcMet基因進行轉錄沉默后，不僅使赤擬谷盜產生了對JH的抗性，而且還引起了幼蟲的早熟變態(tài)。表明Met基因在JH的調控過程

3、中起了重要的作用，并由此推測Met可能是JH的候選受體。 家蠶是重要的經濟昆蟲和鱗翅目模式生物。近年來，研究者在家蠶發(fā)育的激素調控機理研究等方面，取得了諸多突破性進展。本研究基于家蠶基因組精細圖、家蠶全基因組芯片表達數(shù)據(jù)、RACE技術和RNAi技術對家蠶可能的JH受體BmMet基因進行了全長cDNA克隆和基因干涉實驗，初步探討了BmMet基因的功能。獲得的主要研究結果如下： 1.家蠶BmMet基因的全長cDNA克隆

4、 通過生物信息學分析，我們在家蠶基因組精細圖預測基因中鑒定了一個與果蠅DmMet基因有較高相似性的基因，并命名為BmMet。采用RACE-PCR的方法克隆獲得了該基因的全長cDNA序列。BmMet基因cDNA全長為1917 bp，其中ORF有1368bp，編碼455個氨基酸。5'-UTR核苷酸為405bp，3'-UTR核苷酸為144bp，并包含一個32bp的poly(A)尾巴。 2.家蠶BmMet基因的序列結構 通過染

5、色體定位和基因組比較分析發(fā)現(xiàn)，該基因位于家蠶第8號染色體上，整個基因只有1個外顯子，沒有內含子，這與其他昆蟲Met基因中的內含子數(shù)目不同，如黑腹果蠅中存在1個內含子、埃及伊蚊9個、<比亞按蚊7個、赤擬谷盜7個。通過在線SMART程序結構域預測顯示，家蠶BmMet含有與其他昆蟲Met一致的結構域，即bHLH、PAS-A、PAS-B和PAC，推測BmMet基因可能有與其他昆蟲Met基因相類似的功能。 3.家蠶BmMet基因的時空表達

6、特征 采用RT-PCR技術，我們分析了BmMet基因在家蠶不同發(fā)育時期個體和幼蟲5齡第3天不同組織器官中的表達特征。結果表明，BmMet基因在家蠶整個發(fā)育時期都有持續(xù)的表達，在幼蟲5齡第3天的各個組織器官中也都有表達，這與家蠶體內JH滴度的有規(guī)律變化沒有明顯相關性，推測BmMet基因的表達并沒有受到JH的誘導調節(jié)。 4.家蠶BmMet基因功能的RNAi分析 通過dsRNA介導的RNAi實驗，我們對家蠶BmMet基

7、因的功能進行了初探。在幼蟲4齡起蠶將BmMet基因轉錄沉默后，結果發(fā)現(xiàn)，并沒有影響家蠶的正常發(fā)育，家蠶可以正常地蛻去4齡舊表皮而進入5齡，并正常地化蛹、化蛾。這與赤擬谷盜中TcMet基因的干涉效果不同，而與果蠅中DmMet基因缺失后無明顯表型相類似，暗示Met基因在家蠶和果蠅中與其在赤擬谷盜中的作用方式不同。 綜上所述，本研究在家蠶基因組中鑒定并克隆了Met基因的全長cDNA序列，發(fā)現(xiàn)家蠶BmMet基因同其他昆蟲Met基因在序列