家蠶Tudor-SN基因的鑒定及功能分析.pdf

1、自1998年在線蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)RNAi現(xiàn)象以來(lái)的10余年間，利用RNAi手段研究基因功能已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種物種中。隨著對(duì)RNAi機(jī)制的解析，研究者們發(fā)現(xiàn)參與這種保守機(jī)制的蛋白在不同的物種中其實(shí)不完全相同，并且其中還有很多蛋白的功能沒(méi)有得到詮釋。Tudor-SN(TSN)蛋白就是其中之一，雖然是最早被發(fā)現(xiàn)的沉默復(fù)合體(RISC)成員蛋白，但其功能至今為止仍然不清楚。TSN蛋白具有保守的4個(gè)完整的SN結(jié)構(gòu)域，一個(gè)Tudor結(jié)構(gòu)域以及一個(gè)含部分序列

2、的第五SN結(jié)構(gòu)域，保守存在于各物種中。該蛋白在不同的生物體內(nèi)參與不盡相同的調(diào)控途徑，且在同一物種中往往具有多種功能，如：參與激活轉(zhuǎn)錄因子、mRNA剪切、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、降解被修飾的miRNA等。TSN復(fù)雜的結(jié)構(gòu)決定了其作為多功能蛋白參與不同途徑。
　　 對(duì)于鱗翅目昆蟲(chóng)的代表家蠶而言，RNAi也是研究其基因功能的有力工具之一，但是關(guān)于家蠶干涉途徑機(jī)制解析的報(bào)道卻很少。本研究以家蠶TSN為對(duì)象，通過(guò)克隆該基因的CDS，分析了其預(yù)測(cè)氨基酸

3、序列特征；采用免疫染色對(duì)其進(jìn)行亞細(xì)胞定位；在家蠶細(xì)胞中利用熒光雙分子互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證家蠶TSN蛋白和AGO1以及AGO2蛋白的相互作用；構(gòu)建轉(zhuǎn)基因表達(dá)環(huán)狀熒光素酶細(xì)胞系來(lái)檢測(cè)降低tsn基因的表達(dá)是否引起caspase3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。在此基礎(chǔ)上，對(duì)tsn基因進(jìn)行瞬時(shí)干涉檢測(cè)其在家蠶RNAi途徑中的作用，同時(shí)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因過(guò)量表達(dá)tsn基因的細(xì)胞系檢測(cè)其是否有助于提高干涉效率。主要的結(jié)果如下：
　　 1.家蠶tsn基因的序列分析以及表達(dá)特

4、征分析
　　 克隆獲得的家蠶tsn基因cDNA序列為3362bp，其中包括2667bp的ORF，186bp的5'UTR和509bp的3'UTR。ORF編碼含888個(gè)氨基酸的蛋白，分子量為98.88kD，等電點(diǎn)為8.55。該蛋白包含4個(gè)完整的SN結(jié)構(gòu)域，一個(gè)含部分序列的SN結(jié)構(gòu)域以及一個(gè)Tudor結(jié)構(gòu)域，其中在Tudor結(jié)構(gòu)域中包含5個(gè)決定其芳香籠狀結(jié)構(gòu)的保守氨基酸殘基。對(duì)TSN蛋白質(zhì)氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)家蠶的TSN蛋白

5、氨基酸序列與果蠅、線蟲(chóng)和人類(lèi)分別具有52％、51％和43％的相同性，分別具有70％、67％和63％的相似性。通過(guò)RT-PCR發(fā)現(xiàn)家蠶tsn基因在檢測(cè)的家蠶10個(gè)組織中都有表達(dá)，主要在精巢，卵巢以及絲腺中有較高量的轉(zhuǎn)錄，相反，在血液和馬氏管中的表達(dá)量相對(duì)較少。通過(guò)免疫染色發(fā)現(xiàn)，家蠶tsn基因主要在BmN4細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。
　　 2.家蠶TSN與AGO1和AGO2之間的相互作用
　　 在家蠶細(xì)胞中利用熒光雙分子互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)(

6、BiFC)驗(yàn)證家蠶TSN蛋白和AGO1以及AGO2蛋白的相互作用，發(fā)現(xiàn)家蠶TSN蛋白和AGO1以及AGO2蛋白在細(xì)胞質(zhì)中形成復(fù)合體，這個(gè)復(fù)合體可能存在于某個(gè)細(xì)胞器中。由于AGO1和AGO2在P-boby中參與mRNA翻譯抑制，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，我們推測(cè)TSN可能在P-body中協(xié)助AGO1和AGO2參與mRNA翻譯抑制。
　　 3.家蠶BmN4細(xì)胞內(nèi)RNA編輯與RNA干涉途徑之間的拮抗作用分析
　　 最近的報(bào)道表明一些

7、物種中A到I的RNA編輯對(duì)RNA干涉途徑具有抑制作用。被RNA編輯酶ADAR修飾后的dsRNA不能進(jìn)入RNA干涉途徑，而被ADAR修飾后的dsRNA會(huì)被TSN蛋白結(jié)合并降解。家蠶基因組中也存在adar基因，通過(guò)RT-PCR發(fā)現(xiàn)家蠶adar基因主要在頭和表皮中有表達(dá)。在家蠶細(xì)胞中我們通過(guò)干涉adar和tsn基因，以熒光素酶基因?yàn)閳?bào)道基因檢測(cè)干涉效率，發(fā)現(xiàn)共轉(zhuǎn)染72小時(shí)后，干涉了adar和tsn基因后并沒(méi)有影響干涉效率。這表明在我們的實(shí)驗(yàn)條

8、件下，RNA編輯對(duì)RNA干涉途徑并沒(méi)有明顯的拮抗作用。
　　 4.抑制家蠶adar基因和tsn基因后對(duì)家蠶BmN4細(xì)胞引起的凋亡檢測(cè)
　　 由于考慮到ADAR蛋白的修飾作用以及TSN蛋白作為一種多功能蛋白為生物體或者是細(xì)胞生存所必須，再者，已有研究發(fā)現(xiàn)沉默了挪威云杉tsn基因表達(dá)后會(huì)引起植物細(xì)胞異常的細(xì)胞死亡并影響其植物體的繁殖力，因此干涉這兩個(gè)基因后可能會(huì)引起細(xì)胞凋亡。所以我們構(gòu)建轉(zhuǎn)基因表達(dá)環(huán)狀熒光素酶的細(xì)胞系來(lái)檢測(cè)c

9、aspase3引起的細(xì)胞凋亡。但結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在抑制adar和tsn基因后，從細(xì)胞形態(tài)上以及分子水平上與過(guò)量表達(dá)人p53基因的陽(yáng)性對(duì)照比較都沒(méi)有發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。
　　 5.抑制與過(guò)量表達(dá)家蠶tsn基因?qū)倚QBmN4細(xì)胞中干涉效率的影響分析
　　 采用瞬時(shí)干涉檢測(cè)的方法，即在轉(zhuǎn)染雙鏈RNA后24到48小時(shí)內(nèi)檢測(cè)干涉效率，利用不同劑量的tsn基因?qū)?yīng)的dsRNA轉(zhuǎn)染36小時(shí)后發(fā)現(xiàn)，2.5ng到40ng的dsRNA劑量之間報(bào)告基

10、因的表達(dá)量逐漸升高，說(shuō)明干涉效率逐漸下降。而80ngdsRNA處理后干涉效率反而有所提高。我們推測(cè)，前者是由于干涉掉tsn基因而影響到了干涉效率，后者是由于dsRNA劑量太高而產(chǎn)生的非特異干涉現(xiàn)象。同時(shí)，我們構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因過(guò)量表達(dá)tsn基因的細(xì)胞系，并且比較了這種細(xì)胞系和正常細(xì)胞的干涉效率，發(fā)現(xiàn)干涉效率并沒(méi)有因?yàn)閠sn基因的過(guò)量表達(dá)而升高。
　　 綜上所述，本研究在細(xì)胞水平上，通過(guò)亞細(xì)胞定位鑒定出家蠶tsn基因在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)；通過(guò)

11、熒光雙分子實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證出家蠶TSN蛋白和AGO1以及AGO2蛋白之間分別相互作用；構(gòu)建轉(zhuǎn)基因表達(dá)環(huán)狀熒光素酶的細(xì)胞系檢測(cè)干涉，并發(fā)現(xiàn)干涉家蠶adar基因和tsn基因后并不能引起caspase3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；同時(shí)以熒光素酶為報(bào)告基因檢測(cè)A到I的RNA編輯是否對(duì)RNAi途徑具有拮抗作用，研究發(fā)現(xiàn)BmN4細(xì)胞中RNA編輯對(duì)RNAi途徑的拮抗作用并不明顯；為了詳細(xì)研究TSN在家蠶RNAi途徑中的作用，我們采取瞬時(shí)干涉檢測(cè)的方法發(fā)現(xiàn)TSN在家蠶RN