汞(Ⅱ)和菊酯類農(nóng)藥的膠體金檢測(cè)技術(shù)研究.pdf

1、本研究利用金標(biāo)層析試紙技術(shù)，以核酸適體和單克隆抗體為識(shí)別探針，建立了快速檢測(cè)Hg2+和高效氯氰菊酯農(nóng)藥的方法。
　　一、基于核酸適配體檢測(cè)金屬Hg(Ⅱ)的膠體金層析技術(shù)研究
　　利用“指數(shù)式富集配體進(jìn)化系統(tǒng)(systematic evolution of ligands by exponentialenrichment，SELEX)”技術(shù)篩選獲得并改造的核酸適體為標(biāo)記探針，應(yīng)用金標(biāo)層析試紙技術(shù)，建立了快速檢測(cè)Hg2+的膠體金

2、試紙條方法。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.膠體金的制備與優(yōu)化
　　采用檸檬酸三鈉還原法，制備出10nm，15nm，20nm，40nm膠體金，并優(yōu)化膠體金的最佳離心速度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:10nm，15nm，20nm，40nm的膠體金的最佳離心速度分別是:10000rpm，10000rpm，8000rpm，6000rpm，離心時(shí)間15min。
　　2.基于競(jìng)爭(zhēng)抑制原理的金標(biāo)試紙條的設(shè)計(jì)與組裝
　　檢測(cè)T線設(shè)計(jì):以單

3、鏈核酸適體的互補(bǔ)序列為探針，與目標(biāo)化合物Hg2+競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合金標(biāo)核酸適體N5，以競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合導(dǎo)致金顆粒沉積顯色，達(dá)到檢測(cè)目標(biāo)化合物目的。
　　質(zhì)控C線設(shè)計(jì):以對(duì)目標(biāo)化合物無(wú)識(shí)別作用的核酸適體的互補(bǔ)序列poly-A為探針，與無(wú)識(shí)別作用的核酸適體結(jié)合導(dǎo)致金顆粒沉積顯色，設(shè)計(jì)試紙條的質(zhì)控線。
　　結(jié)果表明，設(shè)計(jì)的互補(bǔ)探針中，Hg2+不能競(jìng)爭(zhēng)核酸適體N5的完全互補(bǔ)序列N5-C-5B，但對(duì)部分互補(bǔ)序列MB-1-5具有很好的競(jìng)爭(zhēng)效果，試驗(yàn)選用M

4、B-1-5。
　　3.試紙條的優(yōu)化
　　(1) C/T線包被位置優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:T線的最佳包被位置在距離NC膜下邊緣9mm處，C線在其上端平行距離4-5mm處。
　　(2)競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)劑量的優(yōu)化。通過(guò)改變金標(biāo)結(jié)合物和MB-1-5的包被量，達(dá)到優(yōu)化檢測(cè)靈敏度的目的。將活化的1.0OD的核酸適體N5加到5mL膠體金中，濃縮5倍，設(shè)計(jì)梯度用量包被金標(biāo)墊;將1.0OD MB-1-5與鏈霉親和素反應(yīng)后，用PBS定容至500μL，

5、設(shè)計(jì)梯度用量包被T線;結(jié)果表明，試紙條的最佳競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)包被量為:金標(biāo)結(jié)合物3μL，MB-1-51.5-2.0μL，對(duì)Hg2+裸眼觀察檢測(cè)靈敏度為3μg/mL。
　　(3)最佳膠體金標(biāo)記粒徑的選擇優(yōu)化。將不同粒徑的膠體金與核酸適體結(jié)合，用同樣的方法制作試紙條，比較試紙條的顯色效果和檢測(cè)靈敏度，篩選出檢測(cè)效果最好的膠體金標(biāo)記粒徑。結(jié)果表明:粒徑范圍為15-20nm的膠體金檢測(cè)效果最好，實(shí)驗(yàn)選用粒徑15nm的膠體金。
　　二、基于抗

6、體檢測(cè)高效氯氰菊酯農(nóng)藥的膠體金層析技術(shù)研究
　　本研究使用以PBA-BSA為免疫原制備的抗擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥單克隆抗體，結(jié)合膠體金層析技術(shù)，研制快速檢測(cè)高效氯氰菊酯農(nóng)藥的試紙條。主要研究結(jié)果如下:
　　經(jīng)方法優(yōu)化后，選用15nm的膠體金標(biāo)記抗體，金標(biāo)抗體終濃度為:1.5mg/mL，金標(biāo)墊包被量為2μL;T線包被PBA-OVA，包被濃度為0.25mg/mL，包被量0.8μL;C線包被的是羊抗鼠IgG，包被濃度為0.1mg/mL，