用于食品中鼠疫耶爾森菌的納米膠體金快速檢測(cè)技術(shù)研究.pdf

1、本文基于膠體金顆粒在堿性環(huán)境中帶負(fù)電荷，能與蛋白質(zhì)分子的正電荷基一團(tuán)，借靜電引力而形成牢固結(jié)合的特性標(biāo)記具有高度特異性的鼠疫莢膜F1多價(jià)抗體建立了納米膠體金快速檢測(cè)鼠疫耶爾森氏菌的方法。根據(jù)抗體膠體金與被檢測(cè)物結(jié)合形成穩(wěn)定的肉眼可見(jiàn)結(jié)合物在一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)具有最大吸收峰實(shí)現(xiàn)了膠體金的定量檢測(cè)，主要研究?jī)?nèi)容如下： l.鼠疫菌診斷血清的制備及多價(jià)抗體的純化。根據(jù)典型鼠疫菌在37~C富含血液的培養(yǎng)基中培養(yǎng)能產(chǎn)生大量的F1封套抗原的特性對(duì)

2、典型鼠疫菌進(jìn)行增菌，將獲得的菌種免疫健康家兔，采血分離F1多價(jià)抗體。分離的血清在56~C30分鐘滅能后測(cè)定其效價(jià)，與耐熱及不耐熱鼠疫菌體沉淀原作用為陰性或凝集效價(jià)不低于1：320(H)為合格，制備好的血清置2一10℃?zhèn)溆??？贵w純化方法采用硫酸銨鹽析后透析至無(wú)銨離子為止，冷凍保存。 2.凍干鼠疫菌F1抗原的制備。采用具有豐富莢膜抗原的鼠疫弱毒菌EV株用厚氏培養(yǎng)基大量增菌，于37~C培養(yǎng)收集菌體，用冷丙酮洗滌，置37℃自然干燥，除去

3、剩余丙酮，用乳缽研磨成菌粉，硫酸銨純化，用最適量的Fl抗原溶液致敏經(jīng)鞣酸處理的醛化綿羊紅血球，與鼠疫菌診斷血清(1：320(++)以上)做間接血凝反應(yīng)時(shí)，其效價(jià)應(yīng)達(dá)到1：50000(++)以上，而與假結(jié)核、布氏菌、土拉倫菌血清等應(yīng)為陰性反應(yīng)，即得到純化好的F1抗原，凍干保存。 3.制備膠體金和膠體金探針。采用檸檬酸鈉還原法，制得直徑為lOnm，大小均勻的膠體金顆粒。通過(guò)試驗(yàn)確定F1膠體金最適標(biāo)記蛋白用量為12μg／ml，然后制備

4、標(biāo)記鼠疫F1抗體的膠體金探針，經(jīng)透射電鏡檢測(cè)合格，4~C保存?zhèn)溆谩?4.斑點(diǎn)金免疫滲濾法檢測(cè)鼠疫方法的建立。通過(guò)對(duì)倍比稀釋的鼠疫H抗原和典型的鼠疫EV76菌株進(jìn)行檢測(cè)，9IGFA檢測(cè)F1抗原的最低檢出限為long／m1；對(duì)EV79。的最低檢出限為2．4×105cfu；其特異性除4株鼠疫菌外，不與包括小腸結(jié)腸炎和假結(jié)核耶爾森菌等其它細(xì)菌發(fā)生交叉免疫反應(yīng)；整個(gè)反應(yīng)過(guò)程在lOmin內(nèi)完成。 5.斑點(diǎn)金--薄層色譜法檢測(cè)鼠疫的實(shí)

5、驗(yàn)研究。根據(jù)抗體膠體金與被檢測(cè)物結(jié)合形成穩(wěn)定的肉眼可見(jiàn)結(jié)合物在一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)具有最大吸收峰的特性，通過(guò)CS一930雙波長(zhǎng)色譜掃描儀對(duì)樣品斑點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，斑點(diǎn)金一薄層色譜法對(duì)鼠疫F1抗原的最低檢出限為5ng；對(duì)EV7。的最低檢出限為L(zhǎng)2×10scfu；且二者呈高度的正相關(guān)關(guān)系，前者相關(guān)直線(xiàn)方程為y=448．46737+2．51143x，R=0．9457,P<0．01，后者相關(guān)直線(xiàn)方程為y=375．76088+4．11231×lO-4x，R=

6、0．9242，P<0．05，實(shí)現(xiàn)了膠體金標(biāo)記技術(shù)的定量測(cè)定方法。 6.斑點(diǎn)金免疫滲濾法在我國(guó)各生態(tài)型鼠疫菌檢測(cè)中的應(yīng)用。隨機(jī)抽取分離自不同鼠疫自然疫源地的17個(gè)生態(tài)型的野生型鼠疫菌株17株以及對(duì)照菌株進(jìn)行DIGFA檢測(cè)，結(jié)果只有17株鼠疫菌產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)紅色斑點(diǎn)，而假結(jié)核菌，結(jié)腸炎菌等其它對(duì)照菌株未見(jiàn)紅色斑點(diǎn)，2．4×105cfu可見(jiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，lOmin可以完成檢測(cè)過(guò)程。 7.間接免疫金染色法在鼠疫菌形態(tài)學(xué)鑒定中的初步應(yīng)用