安全轉基因油菜的獲得及其抗菌核病研究.pdf

1、油菜是我國重要的油料作物,菌核病作為油菜生產(chǎn)中最主要的病害,嚴重影響著我國油菜的品質和產(chǎn)量,因此,控制油菜菌核病已成為當前油菜生產(chǎn)中亟待解決的問題。盡管轉基兇技術已在多種作物中取得了巨大的成功,但公眾對轉基因作物生物安全性問題的日益擔憂,明顯限制了轉基因技術在油菜育種中的應用。
　　 研究表明,來自益母草的抗真菌蛋白基因LJAMP2,經(jīng)離體試驗結果顯示對菌核病菌(Sclerotinasclerotiorum)具有很強的抗性。同時

2、,“Gene-deletor”刪除系統(tǒng)在煙草上的成功應用,消除了轉基因植物中可能存在的生物安全性問題。故在本研究中,我們將益母草脂質轉移蛋白基因LJAMP2搭建在“Gene-deietor”刪除系統(tǒng)內并轉化油菜,獲得安全轉基因油菜。本研究的完成,可望為轉基因作物生物安全性的控制提供一個應用于大田生產(chǎn)的技術手段。研究內容如下:
　　 1、含有抗菌肽基因LJAMP2的刪除系統(tǒng)載體pBGP-FLP-LTP-GN的構建
　　 擴

3、增目的基因LJAMP2連接pCXSN載體,測序正確后,雙酶切含目的基因的克隆載體pCXSN-LJAMP2和載體質粒pBGP-FLP-GN,將目的片段35S-LJAMP2-Nos與載體pBGP-FLP-GN酶切大片段連接,構建成植物表達載體pBGP-FLP-LTP-GN并轉化大腸桿菌DH5α,經(jīng)檢測驗證正確后,最后轉化農(nóng)桿菌EHA105得到植物表達載體EHA105-pBGP-FLP-LTP-GN。
　　 2、根癌農(nóng)桿菌介導的油菜菜

4、遺傳轉化及分子檢測
　　 以油菜品種中油821的下胚軸作為轉基因受體材料,利用根癌農(nóng)桿菌介導法轉化來源于益母草的陽離子抗菌肽基因LJAMP2,由花粉特異性啟動子基因BGP控制的刪除系統(tǒng)載體pBGP-FLP-GN,以及含有抗菌肽基因LJAMP2的刪除系統(tǒng)載體pBGP-FLP-LTP-GN。經(jīng)高濃度卡那霉素篩選培養(yǎng)后獲得油菜抗性植株。通過GUS組織化學染色和PCR驗證共獲得3個轉LJAMPP2基因油菜株系,4個轉pBGP-FLP-G

5、N基因油菜株系,1個轉pBGP-FLP-LTP-GN基因油菜株系,檢測結果均呈陽性,初步證明外源目的基因已整合到油菜基因組中。RT-PCR證實LJAMP2和FLP基因分別在轉LJAMP2和轉pBGP-FLP-GN油菜植株中均能大量表達。
　　 3、轉LJAMP2基因油菜抗病性檢測
　　 體外抑菌試驗表明,轉LJAMP2基因油菜細胞粗提液對菌核病病菌的菌絲抑制力明顯強于非轉基因油菜細胞粗提液。進一步將菌核病病菌接種在轉基因

6、和野生型油菜葉片上離體培養(yǎng),結果顯示野生型植株葉片感病快且面積大,而轉LJAMP2基因植株葉片僅少面積感病。顯微鏡下觀察葉片體內病菌菌絲侵染情況,發(fā)現(xiàn)菌核病病菌的菌絲在非轉基因油菜植株中形態(tài)正常,而在轉LJAMP2基因植株葉片中,菌絲變厚變粗,且表現(xiàn)為卷曲形態(tài),在葉片內擴散速度和擴散面積也小于非轉基因植株葉片。上述抗性試驗結果表明,在油菜中超量表達LJAMP2基因能顯著提高對油菜菌核病的抗性。
　　 4、轉pBGP-FLP-GN

7、載體油菜刪除效率檢測
　　 比較處于發(fā)育相同階段的野生型花粉粒,以及轉LJAMP2基因油菜花粉粒的GUS組織化學染色結果,可初步證實在轉pBGP-FLP-GN基因油菜的花粉粒中已實現(xiàn)基因刪除。進一步比較轉pBGP-FLP-GN基因油菜不同階段花粉粒染色結果,顯示花粉粒顏色由藍色逐漸朝黃色變化。對所有計數(shù)花粉粒進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計,結果顯示轉pBGP-FLP-GN載體油菜刪除效率為82.51%。上述結果表明,含有pBGP-FLP-GN載體