豬鏈球菌2型雙組份調(diào)控系統(tǒng)CiaRH調(diào)控基因SSU05-2036和SSU05-2039的功能研究.pdf

1、由豬鏈球菌2型（Streptococcus suissero type2，S.suis2，SS2）引起的豬鏈球菌病是一種重要的人畜共患傳染病，可導(dǎo)致豬的腦膜炎、心內(nèi)膜炎、漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、肺炎和敗血癥等。2005年中國(guó)四川暴發(fā)的豬鏈球菌病不僅給中國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的損失，還給公共衛(wèi)生安全造成很大的威脅。因此，豬鏈球菌2型的致病機(jī)制成了國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。目前已經(jīng)報(bào)道的SS2的毒力（相關(guān)）因子有:莢膜多糖CPS、溶菌酶釋放蛋白MRP和細(xì)

2、胞外因子EF、溶血素Sly、纖連蛋白結(jié)合蛋白FBPS、血清渾濁因子OSF、89K毒力島和雙組份調(diào)控系統(tǒng)等。
　　目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了15對(duì)豬鏈球菌2型的雙組份調(diào)控系統(tǒng)如:CiaRH、SalK/SalR、RevS和2148hk/rr等。CiaRH是肺炎鏈球菌中發(fā)現(xiàn)的第一對(duì)雙組份調(diào)控系統(tǒng)，它不僅能對(duì)單一信號(hào)產(chǎn)生強(qiáng)烈反應(yīng)，而且在各種條件下都能保持高水平的基因表達(dá)。CiaRH參與的反應(yīng)過(guò)程有:感受態(tài)的形成、宿主定植、自溶、細(xì)菌素的產(chǎn)生和毒力等。

3、同時(shí)CiaRH還參與生物被膜的形成，生物被膜在抗生素的耐受和細(xì)菌的免疫逃避方面發(fā)揮重要作用。
　　本課題組李錦銓博士通過(guò)構(gòu)建CiaRH的缺失突變株研究CiaRH對(duì)豬鏈球菌2型的致病性的影響。研究發(fā)現(xiàn)，與野生株SC19相比，突變株對(duì)小鼠和豬的致病力減弱，同時(shí)對(duì)豬的致死率降低。對(duì)生物被膜的研究發(fā)現(xiàn)，CiaRH影響豬鏈球菌2型的生物被膜的形成。然而，CiaRH如何影響豬鏈球菌2型的生物被膜的形成呢？它在豬鏈球菌2型中如何發(fā)揮調(diào)控作用呢？

4、目前還沒(méi)有相關(guān)的報(bào)道。因此，本研究就這個(gè)問(wèn)題開(kāi)展一系列的探究，通過(guò)CiaRH的表達(dá)譜芯片篩選與生物被膜相關(guān)的基因，利用熒光定量PCR和EMSA（凝膠電泳遷移率實(shí)驗(yàn)）等試驗(yàn)驗(yàn)證。然后構(gòu)建相關(guān)基因的缺失株，進(jìn)一步觀察其生物學(xué)特性、生物被膜的形成、對(duì)模型動(dòng)物BALB/c小鼠和小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的侵染情況來(lái)研究這些基因是否影響豬鏈球菌2型的生物被膜的形成以及對(duì)宿主的免疫逃避等方面的影響，進(jìn)而探究豬鏈球菌2型的致病機(jī)制。具體實(shí)驗(yàn)內(nèi)容如下

5、:
　　1、CiaRH調(diào)控基因的篩選及調(diào)控蛋白CiaR的表達(dá)
　　本課題通過(guò)雙組份系統(tǒng)CiaRH的表達(dá)譜芯片篩選出可能與生物被膜相關(guān)的基因:SSU052036和SSU05_2039。我們以菌株05ZYH33基因組為模板，擴(kuò)增得到反應(yīng)調(diào)控蛋白CiaR的基因序列并將其連接到原核表達(dá)載體pET-30a上構(gòu)建出原核表達(dá)質(zhì)粒pET-CiaR。將質(zhì)粒pET-CiaR轉(zhuǎn)化入BL21，然后用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，得到CiaR蛋白。最后通過(guò)E

6、MSA和熒光定量PCR試驗(yàn)驗(yàn)證:CiaR蛋白能夠調(diào)控基因SSU05_2036和SSU05_2039。
　　2、構(gòu)建和鑒定豬鏈球菌2型基因缺失突變株
　　以豬鏈球菌2型05ZYH33(SC19)菌株的全基因組序列為模板擴(kuò)增得到SSU05_2036和SSU05_2039的上下游同源臂，使用溫敏型自殺性質(zhì)粒pSET4s構(gòu)建重組質(zhì)粒pSET4s-2039和pSET4s-2036。通過(guò)壯觀霉素抗性和二次同源重組的方法篩選，成功構(gòu)建缺失

7、突變株ΔSSU05_2036和ΔSSU05_2039。
　　3、缺失株ΔSSU05_2036和ΔSSU05_2039生物學(xué)特性的研究
　　我們對(duì)突變株ΔSSU05_2036和ΔSSU05_2039的生長(zhǎng)曲線、溶血活性、生物被膜的形成進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)進(jìn)行了小鼠的感染試驗(yàn)（LD50和組織載菌量）和吞噬試驗(yàn)。結(jié)果表明基因SSU05_2036和SSU05_2039的缺失對(duì)豬鏈球菌2型的生長(zhǎng)特性和溶血活性沒(méi)有影響，卻導(dǎo)致其生物被膜的形成