蘋果醇?；D(zhuǎn)移酶基因(MdAAT2)啟動(dòng)子克隆與功能鑒定.pdf

1、酯類揮發(fā)性物質(zhì)是構(gòu)成蘋果特征香氣最重要的成份，目前針對(duì)醇?；D(zhuǎn)移酶基因(MdAAT2)調(diào)控機(jī)理的研究，僅限于果實(shí)成熟過(guò)程中乙烯的調(diào)控作用及與果實(shí)品質(zhì)的關(guān)系，而信號(hào)物質(zhì)誘導(dǎo)該基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。本文克隆了蘋果醇酰基轉(zhuǎn)移酶基因(MdAAT2)的啟動(dòng)子，并將其與GUS基因融合，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草，對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行了組織化學(xué)分析和調(diào)控分析，主要結(jié)果如下： 1.MdAAT2啟動(dòng)子序列的克隆將金帥蘋果葉片的基因組DNA稀釋后做模

2、板，利用tail-PCR得到725bp左右的特異產(chǎn)物。以725bp為模板，tail-PCR得到1032bp左右的特異產(chǎn)物。將725bp和1032bp序列拼接出1572bp的序列(基因銀行注冊(cè)號(hào)：EF459693)。以1572bp為模板，在編碼區(qū)ATG的5'端上游設(shè)計(jì)特異引物，以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增出1201bp的特異產(chǎn)物。將擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。利用PCR和酶切鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。 2.M

3、dAAT2啟動(dòng)子克隆片斷的序列比對(duì)把7ZSbp和1032bp序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，在重合區(qū)域，除了5個(gè)堿基有所不同，其余完全吻合，因此得到了兩段序列拼接以后的全序列1572bp。構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，去除編碼區(qū)擴(kuò)增出1201bp啟動(dòng)子序列。將1572bp與1201bp比對(duì)，兩段序列基本吻合，個(gè)別堿基有所不同。 3.MdAAT2啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的確定將cDNA序列與1201bp比對(duì)，得到轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為黑色方框中5'端第一個(gè)字母A。確定了轉(zhuǎn)

4、錄起始位點(diǎn)，就可以對(duì)啟動(dòng)子序列進(jìn)行標(biāo)號(hào)，將轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)標(biāo)為+1，5'上游以負(fù)號(hào)表示。 4.MdAAT2啟動(dòng)子與GUS基因融合引入300bp左右?guī)в蠸peI酶切位點(diǎn)的片段，將連有此片段的pMD載體和pBI載體用BamHI和HindⅢ酶切連接。這樣，改造后的pBI121表達(dá)載體就引入了SpeI酶切位點(diǎn)。用BamHI和SpeI將長(zhǎng)度為1201bp的MdAAT2啟動(dòng)子從克隆載體中切下，定向替換pBI121質(zhì)粒的35S啟動(dòng)子，與GUS基因

5、連接，獲得MdAAT2啟動(dòng)子的植物雙元表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，利用PCR和酶切鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，提取pBI質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。 5.含有MdAAT2啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因煙草的獲得將上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，然后轉(zhuǎn)化煙草。為了進(jìn)一步鑒定抗卡那霉素?zé)煵葜仓甏_實(shí)為轉(zhuǎn)基因植株，提取轉(zhuǎn)基因煙草葉片的基因組，根據(jù)pBI121載體中抗卡那霉素的基因設(shè)計(jì)專一引物，對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行PCR檢測(cè)。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃，預(yù)變性5分鐘；94℃，40秒：58℃，40

6、秒：72℃，90秒；72℃，10分鐘；共35個(gè)循環(huán)。 6.MdAAT2啟動(dòng)子的GUS定量分析和組織化學(xué)分析取MdAAT2轉(zhuǎn)基因煙草的根、莖、葉和花進(jìn)行GUS染色和GUS定量活性分析，發(fā)現(xiàn)MdAAT2啟動(dòng)子可以高效驅(qū)動(dòng)GUS基因在煙草的花器官中表達(dá)，而在葉、莖和根中幾乎檢測(cè)不到GUS活性。對(duì)煙草的花粉囊、花粉、柱頭、胚乳、種子進(jìn)行GUS染色分析，發(fā)現(xiàn)主要在花粉和花粉管中高效表達(dá)。分別用MeJA、SA和ETH處理轉(zhuǎn)基因煙草結(jié)果相同，

7、且處理后藍(lán)色更深更明顯。這說(shuō)明MdAAT2啟動(dòng)子是花粉和花粉管特異表達(dá)啟動(dòng)子。 7.MdAAT2啟動(dòng)子的調(diào)控分析利用PCR技術(shù)對(duì)1201bp啟動(dòng)子進(jìn)行5'端有目的的缺失，分別擴(kuò)增出783bp、716bp、370bp和297bp的片段。用同樣的方法進(jìn)行3'端有目的的缺失，分別擴(kuò)增出1039bp、681bp、259bp和227bp的片段。將所得PCR產(chǎn)物分別克隆到pMD18-T載體中，篩選陽(yáng)性克隆，測(cè)序后發(fā)現(xiàn)所選的8個(gè)陽(yáng)性克隆都含有