橡膠炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)致病相關突變體表型分析及插入位點定位.pdf

1、橡膠樹炭疽病(Rubber plant anthracnose)主要是由膠孢炭疽菌[Colletotrichumgloeosporioides(Penz.)Sacc]侵染造成的,是橡膠樹重要的葉部病害之一。構建炭疽菌ATMT(Agrobacterium tumefaciens-Mediated Transformation)轉化體庫,鑒定相關突變體,利用分子生物學技術分離和鑒定橡膠樹膠胞炭疽菌的致病相關基因,是了解其致病機理及互作機制的

2、重要手段。不僅在植物病理學上有重要意義,而且也為生產上進一步探索新的防病途徑提供線索,為選育持久抗病品種、制定橡膠炭疽病菌持續(xù)管理策略等提供理論依據(jù)。
　　 本研究利用啟動子捕獲技術通過農桿菌介導的遺傳轉化體系構建橡膠炭疽病菌RC-178的突變體庫,使轉化子數(shù)目增加到1685個。通過致病力的測定,從該突變體庫中篩選到15個致病力明顯減弱或喪失的突變體。對這15個突變體進行了生物學特性的觀察分析,發(fā)現(xiàn)2個顏色異常,6個菌落生長緩慢

3、,8個產孢量顯著降低,2個分生孢子形態(tài)異常,2個附著胞形態(tài)異常,3個不能形成附著胞,在洋蔥表皮上侵染釘形成率顯著降低。
　　 對這15個突變體的基因組DNA進行PCR擴增,結果全部都擴增到潮霉素磷酸轉移酶(hph)基因序列,而野生型基因組DNA擴增不到,表明突變體的表型變化是由于外源DNA插入所致。采用TAIL-PCR的方法對這15個突變體基因組DNA進行擴增,得到特異擴增片段,并對這些DNA序列進行克隆和測序,獲得3條序列信息

4、,將這些序列在NCBI網(wǎng)站上進行Blast搜索,結果如下:
　　 突變體T-0900-1的T-DNA插入位點右邊界克隆到1275bp片段,其中950bp-1143bp的134bp與脈孢菌(Neurospora)的一個保守假設蛋白同源性最高,同時966bp-1143bp的113bp與稻瘟菌(Magnaporthe grisea)的70-15保守假設蛋白(MGG_03680)也具有很高同源性。T-0003-3的T-DNA插入位點右邊