l苯丙氨酸生產菌株的構建代謝調控和發(fā)酵條件優(yōu)化

1、L-苯丙氨酸生產菌株的構建、代謝調控和發(fā)酵條件優(yōu)化,王凱,,,,,1,實驗背景及意義,,2,實驗內容,,3,主要框架結構,,4,實驗創(chuàng)新點與難點,實驗可行性分析,,一、研究背景及意義,基于L-Phe廣泛的應用前景，近年來L-Phe成為氨基酸行業(yè)單品中產量增長最快的一種。發(fā)酵法生產L-Phe，國外報道最高產量為50 g/L，L-Phe在我國還未實現(xiàn)大規(guī)模生產，只有十多家公司利用微生物發(fā)酵法生產L-Phe。隨著L-Phe市場需求的增長，國內

2、供需缺口必須及時得到緩解。,,1.1 應用現(xiàn)狀及存在的問題,,,,國內外研究人員在微生物發(fā)酵法生產L-Phe的研究中進行了大量的工作并取得了一些重要研究成果，一些改良的菌株及技術已成功應用于L-Phe的工業(yè)化生產中。然而，相比于其它種類的氨基酸，L-Phe的生產得率仍然較低，已有很多研究者嘗試了不同的方法，但目前仍停留在理論研究或實驗室規(guī)模的發(fā)酵階段。,1.重點在于篩選高產菌株，及如何防止菌株的退化而導致產能下降問題。 2.由于產

3、物抑制和副產物的過量合成等原因，以糖類為主要碳源的發(fā)酵法生產苯丙氨酸時的產物對底物的轉化效率仍然比較低。 3.用于工業(yè)生產的大腸桿菌經常會感染噬菌體病毒。,,1.2 課題的提出,針對以上出現(xiàn)的問題有必要通過代謝工程手段構建一個抗噬菌體污染并能高效生產 L-Phe的重組大腸桿菌，并用發(fā)酵工程的方法提高菌體生產 L-Phe 的能力，以此獲得高產穩(wěn)定的工程菌來滿足生產需求。,,BACK,二、實驗內容,,,,,,實驗內容,發(fā)酵生產L-Ph

4、e的重組質粒的構建,,,,,,抗噬菌體大腸桿菌的篩選,,,,1. L-苯丙氨酸的合成途徑和關鍵酶調控,,,,在研究中，我們從E. coli 抗β-2-噻吩丙氨酸的突變株中獲得一個新的pheAfbr基因，該基因將有可能為CM-PDT對L-Phe的反饋抑制敏感性機制的研究提供有用的信息，并有助于改進菌株生產L-Phe的能力。分析其突變位點和方式，并在低拷貝、溫度誘導表達的質粒中克隆、表達該基因和aroF基因以促進L-Phe的過量合成。,2

5、. 抗噬菌體大腸桿菌的篩選,導致上述構建的重組菌發(fā)酵生產L-Phe異常的主要原因是噬菌體污染。為克服噬菌體污染，我們進行了抗噬菌體并能高產L-Phe的E. coli菌株的選育工作并對突變菌株在外源添加噬菌體條件下的搖瓶和發(fā)酵罐水平的發(fā)酵能力進行了考察。,3.誘導溫度對重組菌發(fā)酵生產苯丙氨酸的影響,溫度作為發(fā)酵過程的重要因素之一，影響與生長代謝相關酶類的催化反應速率及穩(wěn)定性，從而調節(jié)微生物的生長和代謝產物的合成。本章考察不同的誘導溫度對

6、重組菌生產L-Phe 的影響，并分析發(fā)酵動力學參數(shù)的變化趨勢，在此基礎上提出并應用了分階段誘導溫度的控制策略以提高 L-Phe 的生產效率。,三. 研究的主要框架結構,一 發(fā)酵法生產 L-Phe 的重組質粒的構建NTG 誘變及抗β-2-噻吩丙氨酸突變菌株的篩選重組質粒的構建 轉化子的篩選與鑒定,,,,,重組質粒的序列分析重組大腸桿菌的培養(yǎng)酶活性檢測質粒穩(wěn)定性檢測L-Phe 產量的測定,,,,,二 噬菌體

7、的分離、純化及抗噬菌體大腸桿菌的篩選噬菌體 BP-1 的分離、純化NTG 誘變處理大腸桿菌以及篩選大腸桿菌感受態(tài)制備及質粒的轉化方法,,,,對上述構建的重組菌進行發(fā)酵參數(shù)檢測（菌體濃度、葡萄糖濃度和 L-Phe 產量測定）結果與討論,,三 誘導溫度對 重組抗噬菌體菌發(fā)酵生產 L-Phe 的影響培養(yǎng)重組的抗噬菌體菌株在培養(yǎng)過程中改變培養(yǎng)溫度（設三個溫度梯度）分析不同的誘導溫度發(fā)酵動力學參數(shù)的變化趨勢。（酶活、

8、L-Phe產量、菌體濃度、質粒的穩(wěn)定性等）結果分析,,,,四. 研究創(chuàng)新點及難點,實驗難點,BACK,五.實驗可行性分析,1.通過大量查看有關于發(fā)酵法生產苯丙氨酸的資料，對其發(fā)酵代謝途徑有了比較深刻的認識，對接下來研究提供理論基礎幫助。2.實驗用的大腸桿菌可通過自行培養(yǎng)獲得，培養(yǎng)方便，成本低。3.在細菌，尤其是E. coli 中，芳香族氨基酸生物合成途徑的關鍵酶、相應的基因、代謝中間體以及調控方式等已研究得相當清楚。4.實驗室具