重組蛋白藥物純化與質(zhì)量控制

1、重組蛋白藥物純化與質(zhì)量控制,醫(yī)藥生物技術(shù)中試實(shí)驗(yàn)鄔婧2017.5.3,www.themegallery.com,LOGO,Contents,,www.themegallery.com,LOGO,,,,生化分離技術(shù),基因重組技術(shù),免疫檢測(cè)技術(shù),,給人類(lèi)帶來(lái)了抗體和藥物。,現(xiàn)代生物技術(shù),蛋白純化原則,www.themegallery.com,LOGO,,蛋白純化原則,www.themegallery.com,LOGO,蛋白純化原

2、則Guidelines for Protein Purification,確定目標(biāo)purity, quantity, biological activity, economy充分了解目的蛋白及主要雜質(zhì)的理化特性to simplify technique selection and optimisation確定活性測(cè)定方法fast detection of protein activity/recovery and criti

3、cal contaminants 盡量減少純化步驟extra steps reduce yield and increase time, combine steps logically,www.themegallery.com,LOGO,動(dòng)物,植物,培養(yǎng)物,純化流程,www.themegallery.com,LOGO,純化流程,www.themegallery.com,LOGO,濃縮保存狀態(tài)保存條件保存期限……,純化流程,w

4、ww.themegallery.com,LOGO,純化流程,www.themegallery.com,LOGO,Capture,,,,,,,,Resolution,Speed,Recovery,Capacity,Initial purification of the target molecule from crude or clarified source material Concentration and stabi

5、lization (e.g. removal of proteases),,,www.themegallery.com,LOGO,Intermediate Purification,,,,,,,,,Resolution,Speed,Recovery,Capacity,Removal of bulk impurities,,,www.themegallery.com,LOGO,Polishing,,,,,,,,,Resolution,Sp

6、eed,Recovery,Capacity,Final removal of trace contaminants, e.g. structural variants of the target protein,,,www.themegallery.com,LOGO,一般生產(chǎn)純化不超過(guò)4個(gè)步驟。,純化流程,www.themegallery.com,LOGO,分離純化機(jī)制,,,,,,帶電基團(tuán),不同的大小和尺寸,疏水基團(tuán),相互作用,極性不

7、同,www.themegallery.com,LOGO,,,分離純化機(jī)制,不同層析介質(zhì)的成本：離子交換，金屬螯合，疏水層析，分子篩，親和層析,www.themegallery.com,LOGO,,,穩(wěn)定性（PH值，活性）等電點(diǎn)疏水性分子大小，形狀。關(guān)鍵輔助因子,關(guān)鍵雜質(zhì)產(chǎn)品濃度引進(jìn)污染物產(chǎn)品純度單位成本產(chǎn)量,檢測(cè)方法-質(zhì)量控制,純化方法,純化總結(jié),www.themegallery.com,LOGO,,,純化總結(jié),www

8、.themegallery.com,LOGO,,Develop assay methodsSet the aims Characterize the target proteinUse different separation principlesUse few stepsLimit sample handling between purification stepsRemove proteases quicklyRedu

9、ce volume in early stepTRY!,純化總結(jié),www.themegallery.com,LOGO,19,重組蛋白藥物的質(zhì)量控制,www.themegallery.com,LOGO,20,常規(guī)質(zhì)量控制方法,www.themegallery.com,LOGO,21,聚丙烯酰胺凝膠(PAG),單體：丙烯酰胺(Acr)交聯(lián)劑：甲叉雙丙烯酰胺(Bis)聚合劑：過(guò)硫酸銨（APS）催化劑：四甲基乙二胺(TEMED）產(chǎn)物：

10、三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠.,電泳(E),帶電顆粒（蛋白質(zhì)）在電場(chǎng)作用下，在PAG上向著與其電荷相反的電極移動(dòng)，從而達(dá)到分離的效果。,,SDS-PAGE,www.themegallery.com,LOGO,22,蛋白質(zhì)在PAGE中的分離因素,電荷因素分子大小分子形狀,SDS-PAGE,,23,靈敏度1mg,(1) 純度分析(2) 分子量的測(cè)定(3) 初步鑒定(4) 含量的測(cè)定 (配合掃描半定量)(5) 水解的分析 (

11、如酶譜法)(6) Western Blotting的前部分(7) 氨基酸序列分析-結(jié)合質(zhì)譜,SDS-PAGE,www.themegallery.com,LOGO,,,SDS-PAGE,www.themegallery.com,LOGO,,,電泳出現(xiàn)兩條或者兩條以上條帶免疫印跡,SDS-PAGE,www.themegallery.com,LOGO,,,將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測(cè)反應(yīng)來(lái)檢測(cè)樣品。,印跡法(Blottin

12、g),通過(guò)電泳將樣品中的不同蛋白分離開(kāi)，然后將蛋白樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，利用相應(yīng)的抗體來(lái)檢測(cè)目的蛋白的一種方法。,Western印跡法,Werstern Blot,,www.themegallery.com,LOGO,27,膜的特點(diǎn),,,www.themegallery.com,LOGO,,28,半干轉(zhuǎn) 用濾紙吸Buffer來(lái)做轉(zhuǎn)移體系 適合轉(zhuǎn)移小分子量的蛋白； 半干轉(zhuǎn)的電流大小是按照面積來(lái)算的， 時(shí)間是根據(jù) 蛋

13、白分子大小定的； 56mA/膜 1h 濕轉(zhuǎn) 將膜、膠、濾紙全浸泡在Buffer的Tank里 適合轉(zhuǎn)移大分子量（100KD以上）蛋白； 濕轉(zhuǎn)電流是恒定的，時(shí)間也是根據(jù)分子量而定； 300mA 1h,,Werstern Blot,轉(zhuǎn)移方法,www.themegallery.com,LOGO,,Werstern Blot,直接法,優(yōu)點(diǎn)：1.快速（一種抗體）2.沒(méi)有二抗交叉反應(yīng)引起的非特異性條帶缺點(diǎn)：1.免疫反應(yīng)性降

14、低2.無(wú)信號(hào)二級(jí)放大3.抗體標(biāo)記費(fèi)時(shí)昂貴,使用不方便,www.themegallery.com,LOGO,,,間接法,Werstern Blot,優(yōu)點(diǎn)：1. 免疫特異性不受標(biāo)記影響2. 信號(hào)放大靈敏度高（多個(gè)二抗結(jié)合位點(diǎn)）3. 多種標(biāo)記的二抗可供選擇4. 可選擇不同的Marker缺點(diǎn)：1. 交叉反應(yīng)引起的非特異性條帶2. 額外的二抗孵育以及條件優(yōu)化,www.themegallery.com,LOGO,,,顯色,,放射自

15、顯影 底物化學(xué)發(fā)光ECL 底物熒光ECF 底物DAB呈色 　　 ECL:（二抗用HRP標(biāo)記）：反應(yīng)底物為過(guò)氧化物+魯米諾，如遇到HRP，即發(fā)光，可使膠片曝光，就可洗出條帶。,Werstern Blot,32,靈敏度1-5ng,目的蛋白的表達(dá)特性分析目的蛋白的組織定位目的蛋白與其它蛋白的互作目的蛋白的表達(dá)量分析,Werstern Blot

16、,www.themegallery.com,LOGO,,,33,33,,,,,,,Werstern Blot,www.themegallery.com,LOGO,,,ELISA,ELISA(Enzyme-linked Immunosorbent Assay)用酶標(biāo)記抗原或抗體檢測(cè)液體（血液、細(xì)胞液）中未知抗體或抗原的方法。,優(yōu)點(diǎn)：快速、靈敏、定性、定量、定位，是目前應(yīng)用最廣泛的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)。,www.themegallery.co

17、m,LOGO,,,ELISA,（1）  直接法測(cè)定抗原A.      將待測(cè)抗原吸附在載體表面；B.      加酶標(biāo)抗體，形成抗原—抗體復(fù)合物；C. 加底物。,www.themegallery.com,LOGO,,,（2）間接法測(cè)定抗體A.      將抗原吸附于

18、固相載體表面；B.      加待測(cè)抗體, 形成抗原-抗體復(fù)合物; C.      加酶標(biāo)抗體；形成抗原-抗體-抗抗體復(fù)合物；D. 加底物。,ELISA,www.themegallery.com,LOGO,,,（3）雙抗體夾心法測(cè)定抗原A.     將抗體吸附于固相表面;

19、B.     加待測(cè)抗原，形成抗原-抗體復(fù)合物; C.     加酶標(biāo)抗體，形成抗體-抗原-抗體的夾心復(fù)合物； D. 加底物。,ELISA,www.themegallery.com,LOGO,,ELISA,（4）競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定抗原A.     將抗體吸附在固相載體表面; B. 同時(shí)加入酶標(biāo)抗

20、原和待測(cè)抗原，競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體； 對(duì)照只加入酶標(biāo)抗原； C. 加底物。對(duì)照孔與樣品孔差＝未知抗原量。,39,靈敏（納克水平）、特異、簡(jiǎn)單、快速、易于自動(dòng)化操作。一天之內(nèi)可以檢查幾百甚至上千份標(biāo)本，高通量檢測(cè)篩選。應(yīng)用：1、定量檢測(cè)抗原或抗體成份。 2、研究抗酶抗體的合成。 3、顯現(xiàn)微量的免疫沉淀反應(yīng)。 4、免疫酶染色各種細(xì)胞內(nèi)成份的定位。,ELISA,40,www.hfwykj.c

21、om,,輸液系統(tǒng),,進(jìn)樣系統(tǒng),,分離系統(tǒng),,檢測(cè)系統(tǒng),,數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),工作原理,HPLC是以液體為流動(dòng)相，并用高壓輸送，色譜柱采用填充顆粒十分細(xì)小的高效分離柱，柱后連有高靈敏度的檢測(cè)器，可對(duì)流出物進(jìn)行連續(xù)檢測(cè).,,HPLC,41,HPLC,42,HPLC的圖形結(jié)果,色譜圖(Chromatogram) : 色譜柱流出物通過(guò)檢測(cè)器時(shí)所產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)對(duì)時(shí)間的曲線圖,其縱坐標(biāo)為信號(hào)強(qiáng)度,橫坐標(biāo)為時(shí)間,←色譜峰,時(shí)間(分),基線↓,,,峰

22、高,,,峰寬,響應(yīng)值,HPLC,43,從色譜流出曲線中，可得許多重要信息： 根據(jù)色譜峰的個(gè)數(shù)，可以判斷樣品中所 含組分的最少個(gè)數(shù) 根據(jù)色譜峰的保留值，可以進(jìn)行定性分析 根據(jù)色譜峰的面積或峰高，可以進(jìn)行定量分析 根據(jù)色譜峰的保留值及其區(qū)域?qū)挾?，是評(píng)價(jià)色譜柱分離效能的依據(jù) 根據(jù)色譜峰兩峰間的距離，是評(píng)價(jià)固定相（或流動(dòng)相）選擇是否合適的依據(jù)(R值）,HPLC,44,在生化中,主要用在下面幾處: 1．純

23、度；2．分子量；3．肽譜;4．分離制備蛋白質(zhì)和肽；5．脫鹽。,Application,靈敏度0.1ng/mL,HPLC,www.themegallery.com,LOGO,45,常規(guī)質(zhì)量控制方法,Thank You !,www.themegallery.com,LOGO,SOP: Standard Operation Procedure 標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)程序,www.themegallery.com,LOGO,www.themegal