海洋抑菌放線菌的篩選、鑒定及其抑菌活性物質(zhì)研究.pdf

1、隨著抗生素的大量使用，病原菌耐藥性逐漸增強(qiáng)。因此，新型生物活性物質(zhì)的持續(xù)開(kāi)發(fā)以應(yīng)對(duì)病原菌耐藥性增強(qiáng)的速度成為當(dāng)前醫(yī)藥界的迫切需要。海洋微生物資源豐富，環(huán)境獨(dú)特使得海洋微生物能夠產(chǎn)生許多結(jié)構(gòu)新穎的生物活性物質(zhì)。放線菌是產(chǎn)生生物活性物質(zhì)的主要產(chǎn)生菌，從海洋中篩選產(chǎn)生物活性物質(zhì)的海洋放線菌是近年來(lái)研究熱點(diǎn)，且很多新型海洋生物活性物質(zhì)具備良好的應(yīng)用前景。本研究從東海海泥樣品中篩選出一株抑菌譜廣、抑菌活性強(qiáng)的海洋放線菌，并對(duì)其進(jìn)行了鑒定；研究了抑

2、菌物質(zhì)的理化性質(zhì)；優(yōu)化了該菌的發(fā)酵培養(yǎng)基；并初步研究了該菌對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌ATCC19114的作用機(jī)理。具體內(nèi)容如下：
　　1.海洋抑菌放線菌的篩選與鑒定
　　采用瓊脂塊法初篩，打孔擴(kuò)散法復(fù)篩從東海海泥樣品中篩選出12株具有抑菌活性的海洋放線菌，其中 Y10、Y11、Y15、Y16和 Y21具有較強(qiáng)的抑菌性，且Y15在四種發(fā)酵培養(yǎng)基中均能產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)。通過(guò)抑菌譜分析表明Y15抑菌譜最廣，對(duì)20株指示菌中的18株表現(xiàn)

3、出抑菌作用，尤其對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌,金黃色葡萄球菌，維氏氣單胞菌抑菌作用極強(qiáng)，因此被確定為目標(biāo)菌。通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察和16S rRNA基因序列同源性分析鑒定菌株Y15屬于小單孢菌屬，獲得GenBank登錄號(hào)為：KU517850。
　　2. Y15抑菌物質(zhì)性質(zhì)研究
　　研究了Y15抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生隨時(shí)間變化關(guān)系曲線和Y15傳代穩(wěn)定性。對(duì)Y15抑菌物質(zhì)溫度穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、紫外穩(wěn)定性、酶水解穩(wěn)定性和極性大小進(jìn)行了分析。Y15在1

4、48 h抑菌活性最大，達(dá)到480 AU/mL，在168-216 h保持平衡為320 AU/mL，在48-216 h為生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，在216-288 h為生長(zhǎng)穩(wěn)定期。Y15傳代穩(wěn)定性較好，在第1代到第7代菌體保持穩(wěn)定。Y15抑菌活性物質(zhì)在-20-60℃抑菌活性保持穩(wěn)定，在80-120℃活性逐漸下降。Y15抑菌活性物質(zhì)在pH7.0-10.0之間保持穩(wěn)定的抑菌活性，在酸性和強(qiáng)堿性條件下抑菌活性均下降。Y15抑菌物質(zhì)具有良好的紫外穩(wěn)定性。抑菌物質(zhì)

5、對(duì)四種酶水解作用下保持穩(wěn)定，表明Y15抑菌物質(zhì)為非蛋白和多肽類物質(zhì)。Y15抑菌物質(zhì)被乙酸乙酯萃取的效果最佳，濃縮之后活性可達(dá)5200 AU/mL，表明抑菌物質(zhì)具有中等極性。
　　3. Y15發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化
　　通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了Y15發(fā)酵培養(yǎng)條件，利用響應(yīng)面法優(yōu)化了Y15發(fā)酵培養(yǎng)基成分。確定最優(yōu)培養(yǎng)條件為溫度30℃，培養(yǎng)基初始pH為7.20，接種量為4％，搖床轉(zhuǎn)速為180 rpm。單因素實(shí)驗(yàn)選擇可溶性淀粉、牛肉膏、胰蛋白胨

6、、NaCl、K2HPO4、MgSO4和FeSO4為影響因子；通過(guò)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)確定影響抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)生的顯著因素為K2HPO4、可溶性淀粉和牛肉膏；最陡爬坡實(shí)驗(yàn)確定中心點(diǎn)為：K2HPO4為1.00 g/L，可溶性淀粉為25.00 g/L，牛肉膏為18.00 g/L；CCD實(shí)驗(yàn)確定最佳培養(yǎng)基配方為：K2HPO4為1.03 g/L，可溶性淀粉為27.67 g/L，牛肉膏為18.30g/L，胰蛋白胨為7.50 g/L，F(xiàn)e

7、SO4為0.02 g/L，NaCl為0.38 g/L，MgSO4為0.75 g/L，在此濃度水平下預(yù)測(cè)最大抑菌活性為1174.63 AU/mL。驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)測(cè)得的實(shí)際抑菌活性為1236.79±14.56 AU/mL，與預(yù)測(cè)值無(wú)顯著差異，相比于優(yōu)化前抑菌活性提高了3.86倍。
　　4. Y15抑菌活性物質(zhì)抑菌機(jī)理初步研究
　　探討了Y15抑菌物質(zhì)抑制單核細(xì)胞增生李斯特菌ATCC19114的作用機(jī)理。結(jié)果表明 Y15抑菌物質(zhì)對(duì)指示

8、菌生長(zhǎng)曲線具有顯著影響；對(duì)細(xì)胞壁無(wú)損傷作用；胞內(nèi)離子發(fā)生泄露，而大分子物質(zhì)沒(méi)有泄露，推斷對(duì)細(xì)胞膜損傷不大；掃描電鏡下，經(jīng) Y15抑菌物質(zhì)處理的指示菌細(xì)胞形態(tài)發(fā)生皺縮、彎曲，但并未導(dǎo)致細(xì)胞裂解，證實(shí)上述推斷。另一方面，Y15抑菌物質(zhì)對(duì)指示菌DNA并無(wú)影響，但會(huì)使指示菌可溶性蛋白表達(dá)量減少，推斷 Y15的作用機(jī)理可能是通過(guò)影響指示菌胞內(nèi)可溶性蛋白表達(dá)和改變細(xì)胞膜通透性使指示菌的生長(zhǎng)受到抑制甚至死亡，具體機(jī)理有待進(jìn)一步研究。
　　小單孢

9、菌是稀有放線菌，且小單孢菌菌產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)僅次于鏈霉菌，具有重要開(kāi)發(fā)價(jià)值。Y15與M.endolithica具有很高的相似度，M.endolithica是一株小單孢菌菌新種，目前發(fā)現(xiàn)的該菌并未有抑菌活性的報(bào)道，Y15卻具有極好的抑菌性。Y15抑菌譜廣，對(duì)水產(chǎn)品病原菌如L. monocytogenes,S. aureus,A. veronii和V. parahaemolyticus均具有極強(qiáng)的抑菌性，因此Y15在水產(chǎn)品病原菌防治中也具