巨噬細(xì)胞酸性磷酸酶的顯示

1、細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)1巨噬細(xì)胞酸性磷酸酶的顯示巨噬細(xì)胞酸性磷酸酶的顯示一、一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康囊孕∈蟾骨痪奘杉?xì)胞為材料，通過(guò)顯示其溶酶體代表酶—酸性磷酸酶，學(xué)習(xí)酶細(xì)胞化學(xué)的一般原理及方法。二、二、實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理酸性磷酸酶能分解磷酸脂（常用β甘油磷酸鈉）而釋放出磷酸基。在pH5.0的環(huán)境中，磷酸基能與鉛鹽（硝酸鉛，捕捉劑）反應(yīng)形成無(wú)色的磷酸鉛（微細(xì)沉淀，可在電鏡下觀察），再經(jīng)過(guò)與硫化銨作用，形成棕黑色的硫化鉛沉淀（可在光鏡下觀察），以此顯示酸

2、性磷酸酶在細(xì)胞內(nèi)的存在與分布。三、三、實(shí)驗(yàn)儀器及試劑實(shí)驗(yàn)儀器及試劑a)小白鼠：實(shí)驗(yàn)前2天，一部分腹腔注射4%淀粉肉湯1mL誘導(dǎo)及活化巨噬細(xì)胞，另一部分不作處理。b)試劑：4％淀粉肉湯，10％中性福爾馬林（pH6.8~7.1），酸性磷酸酶作用液（現(xiàn)配），1％硫化銨溶液。c)水浴箱（50℃，37℃）、低溫冰箱、普通光學(xué)顯微鏡，小剪刀、5mL一次性注射器、10mL玻璃離心管、試管架、塑料滴管、載玻片染色盒（缸）、自制濕盒、塑料培養(yǎng)皿、蓋玻片、

3、載玻片。四、四、實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟a)巨噬細(xì)胞收集：分別用脫頸法處死一只腹腔注射4％淀粉肉湯1mL的小鼠和一只不注射的小鼠。然后都在腹腔注入2mL生理鹽水，揉勻；剪開(kāi)腹部皮膚，暴露腹膜；用帶針頭的注射器插進(jìn)腹腔吸取腹腔液。b)細(xì)胞黏附：對(duì)于注射了淀粉肉末的小鼠腹腔液一組共做6片，每片2~3滴，其中放入4℃冰箱黏附30min的每人一片；而放入濕盒內(nèi)，50℃水浴30min，滅活酸性磷酸酶的則2人一片。對(duì)于未注射淀粉肉末的小鼠腹腔液則只做置于4

4、℃下的4個(gè)片子即可。c)固定：將所有載玻片置于放有預(yù)冷的10％中性福爾馬林的缸內(nèi)在4℃冰箱中固定30min。d)自來(lái)水漂洗并浸于自來(lái)水中5min。e)加酸性磷酸酶作用液反應(yīng)：再將水甩干，每個(gè)裝片加入足量的酸性磷酸酶作用液，放在37℃的水浴鍋中反應(yīng)30min。f)用自來(lái)水漂洗片刻。g)加硫化銨反應(yīng)：在通風(fēng)櫥中，加入1%硫化銨溶液后反應(yīng)10min。h)在通風(fēng)櫥中自來(lái)水沖洗。i)帶水加蓋玻片顯微觀察。陽(yáng)性標(biāo)本細(xì)胞質(zhì)中，出現(xiàn)許多棕色或棕黑色的顆

5、粒和斑塊。五、五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果a)注射淀粉肉湯的在4℃下染色的圖片細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)3圖中細(xì)胞較大的為巨噬細(xì)胞，且因?yàn)榧?xì)胞中的酸性磷酸酶未遭到破壞，所以被染上棕色。但是因?yàn)闆](méi)有注射淀粉肉湯，所以圖中的巨噬細(xì)胞相對(duì)于注射淀粉肉湯的巨噬細(xì)胞數(shù)量較少。六、六、實(shí)驗(yàn)分析實(shí)驗(yàn)分析a)由上述所有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知道注射肉湯的巨噬細(xì)胞的數(shù)量更多，而且由細(xì)胞中棕色顆粒數(shù)量及顏色可以看出注射淀粉肉湯的巨噬細(xì)胞中的酸性磷酸酶的活性更高。b)50℃的時(shí)候，細(xì)胞中

6、的磷酸酶的活性被破壞，所以無(wú)法被染上色。而在4℃磷酸酶只是暫時(shí)失活，在室溫下進(jìn)行染色時(shí)，磷酸酶的活性恢復(fù)，所以能被染上色。c)但是，圖上細(xì)胞外也有很多的棕色顆粒，我不清楚是什么原因造成的。七、七、注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)a)巨噬細(xì)胞一定要預(yù)先用淀粉肉湯激活，否則酸性磷酸酶活性差，染色淺。b)作用液應(yīng)在臨用時(shí)現(xiàn)配，儲(chǔ)存一段時(shí)間后會(huì)產(chǎn)生絮狀沉淀，影響反應(yīng)效果。c)孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)也可發(fā)生酶擴(kuò)散。d)避免酸性磷酸酶作用液在反應(yīng)過(guò)程中干燥，否則其中的鉛離子