免疫組化實驗步驟

1、免疫組化操作步驟免疫組化操作步驟一、實驗原理與意義免疫組織化學又稱免疫細胞化學，是指帶顯色劑標記的特異性抗體在組織細胞原位通過抗原抗體反應和組織化學的呈色反應，對相應抗原進行定性、定位、定量測定的一項新技術。它把免疫反應的特異性、組織化學的可見性巧妙地結合起來，借助顯微鏡(包括熒光顯微鏡、電子顯微鏡)的顯像和放大作用，在細胞、亞細胞水平檢測各種抗原物質(zhì)(如蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、病原體以及受體等)。（一）、儀器設備1.18cm不銹鋼高壓

2、鍋或電爐或用微波爐.2.水浴鍋（二）、試劑1.PBS緩沖液（ph7.2―7.4）：NaC137mmolL，KCl2.7mmolLNa2HPO44.3mmolLKH2PO41.4mmolL.20.01molL檸檬酸鈉緩沖液（CBph6.01000ml）：檸檬酸三鈉3g檸檬酸0.4g。30.5molLEDTA緩沖液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA2H2O用10mmolLNaOH調(diào)至ph8.0加水至1000ml.4.1m

3、olL的TBS緩沖液（ph8.0）：在800ml水中溶解121gTris堿，用1N的HCl調(diào)至pH8.0加水1000ml。5.酶消化液：a.0.1%胰蛋白酶:用0.1%CaCl12(ph7.8)配制。b.0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。6.3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制7.風裱劑：a.甘油和0.5mmolL碳酸鹽緩沖液（pH9.0–9.5）等量混合b油和TBS(PBS)配制8TBSPBSPH9.

4、0–9.5適用于熒光纖維鏡標本ph7.07.4適合光學纖維標本（三）、操作流程1、脫蠟和水化：脫蠟前應將組織芯片在室溫中放置60分鐘或60℃恒溫箱中烘烤20分鐘。a組織芯片置于二甲苯中浸泡10分鐘更換二甲苯后在浸泡10分鐘b無水乙醇中浸泡五分鐘c95%乙醇中浸泡五分鐘d75%乙醇中浸泡五分鐘2、抗原修復：用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片：A抗原熱修復a高壓熱修復在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m枸櫞酸鈉緩沖溶液（ph6.0

5、）.蓋上不銹鋼鍋蓋，但不能鎖定。將玻片置于金屬染色加上，緩慢加壓，是玻片在緩沖液中浸泡五分鐘，然后將蓋子鎖定，小閥門將會升起來。10分鐘后除去熱源，置入涼水中，當小閥門沉下去后打開蓋子。此方法適用于較難檢測或核抗原的抗原修復。（6）滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘，甩去多余液體（7）滴加Ι抗50μl室溫靜置1小時或4℃過夜或37℃1小時（8）PBS洗3次各2分鐘（9）滴加生物素化Ⅱ抗，20℃37℃20分鐘（10）PBS洗3次各2分鐘

6、（11）滴加試劑SABC20℃30℃20分鐘（12）PBS洗4次各5分鐘（13）DAB顯色：試劑盒或自配顯色劑顯色（14）脫水、透明、封片、鏡檢。免疫組化問題解答免疫組化問題解答1、染色過強、染色過強原因解決方法a抗體濃度過高或孵育時間過長降低抗體滴度、抗體孵育時間：室溫1小時或4度過夜b孵育溫度過高超過37度一般在室溫2028度cDAB顯色時間過長或濃度過高顯色時間不超過512分鐘，以顯微鏡下觀察為準2、非特異性背景染色、非特異性背景