發(fā)酵來源的化學藥物的菌種鑒別

1、發(fā)酵來源的化學藥物的菌種鑒別發(fā)酵來源的化學藥物的菌種鑒別審評四部審評七室張明平通過發(fā)酵獲得的化學藥物同其他化學合成的藥物一樣，審評時應適用同樣的技術要求。但通過發(fā)酵獲得的化學藥物同純化學合成的藥物也存在不一樣的特點，在應用以上原則時會有不同的具體要求。在發(fā)酵的過程中，原本在化學合成中的一步或多步化學反應在菌體內，通過菌體的初級或次級代謝完成。而目前尚無有效手段，可對這些代謝過程如調控化學反應一樣進行精細的監(jiān)控。但可以通過對菌種，發(fā)酵條件

2、和工藝過程的確認，間接的判斷生產工藝的可行性。為了降低這種間接的判斷帶來的藥品質量方面的安全性風險。因此研發(fā)單位應對菌種鑒別和發(fā)酵工藝進行深入研究；尋找藥品質量與二者之間的直接聯(lián)系，判斷和控制影響藥品質量的關鍵參數(shù)。本文將根據(jù)文獻調研的結果，結合審評工作的實踐，對發(fā)酵來源的化學藥物的菌種鑒別的技術要求談一點自己的看法。通過發(fā)酵得到的藥物很多，大體可分為以下三類。第一類是由生物整體或部分實體的藥物；如菌苗、疫苗、類毒素等自動免疫制品；抗毒

3、素、抗血清等被動免疫制品；診斷用菌液、血清、毒素、抗原、抗體等診斷制劑以及治療用抗體制劑等，統(tǒng)稱為生物制品。該類制品不在本文討論的范疇。第二類為微生物初級代謝產物；如構成機體大分子骨架的氨基酸、核苷酸，和輔酶、酶的輔基、維生素等非機體構成物以及與物質代謝、能量代調有關的有機酸、醇類等。第三類為來源于微生物次級代謝產物的藥物；其中最著名的一類藥物就是抗生素；其他還包括酶抑制劑與誘導劑，免疫調節(jié)劑與細胞功能調節(jié)劑、受體拮抗劑與激動劑以及具有

4、其他藥理活性的物質。初級代謝產物和次級代謝產物的生產依賴于其生產菌種特異性的積累目標產物，因此原則上要求菌種鑒別的專屬性越高越好；一般應當將生產菌株與同種不同株的其他菌株區(qū)分開。對菌株進行鑒別提供形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化特征、細胞壁化學成分四方面的資料。此外還可采用DNA雜交法，16SrRNA基因序列分析，RELP，RAPD等手段對對同一種屬的不同菌株進行鑒別。但因初級代謝產物主要是生長所必須的小分子化合物，代謝路徑較明確，在各種生

5、物中差異較??；因此對菌種鑒別可適當放寬技術要求。如氨基酸生產菌的菌株多為某些營養(yǎng)缺陷型的菌株，因此結合形態(tài)特征資料和生理生化特征資料就可以較好的保證菌株的專屬性。次級代謝產物通常與微生物的基本生命活動無關，其合成過程要比初級代謝復雜得多；但從次級代謝產物中分離得到的有用的藥物也要多得多。次級代謝過程按照起始分子和反應模式可進行如下劃分：I級反應，初級代謝產物被轉化為次級凝膠孔徑時即達到分辨力的極限此時凝膠不能再按分子大小篩分DNADNA

6、象通過彎管一樣以其一端指向電場一級而通過凝膠。這種遷移模式謂之“爬行”。即使低濃度的瓊脂糖也不能分辨大于750kb的線狀DNA分子。PFGE在凝膠上外加正交的交變脈沖電場。每當電場方向改變后大DNA分子便滯留在爬行管里直至沿新的電場軸向重新定向后才能繼續(xù)向前移動DNA分子越大這種重排所需要的時間就越長。若DNA分子變換方向的時間小于電脈沖周期時.DNA分子就可以按大小分開?，F(xiàn)在已可分辨大于5000kb的DNA分子。PFGE被認為是分子生

7、物學分類方法的“金標準”，可用于比較不同的菌株。但PFGE耗時較長需2～3天。【4】RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymphisml)限制性片段長度多態(tài)性。不同細菌有其獨特的核苷酸序列用同一種限制性內切酶切割不同細菌基因組DNA后會產生不同長度的限制性片段這種限制性片段長度多態(tài)性可通過電泳分析表現(xiàn)出來。RFLP作為檢測細菌種內或種間DNA水平的最敏感的方法之一，可作為種以下菌株間的鑒定方法?！?】RAP

8、D(RomAmplifiedPolymphicDNA)隨機擴增多態(tài)性技術其原理為:采用核苷酸序列的隨機引物進行基因組DNA擴增非特異性引物可以結合在模板DNA的多個位點產生多個PCR產物采用瓊脂糖凝膠電泳將產物分離開將每株菌在每條引物下擴增后產生的圖譜合成為針對一株菌的單一圖譜再通過軟件進行分析。此方法的敏感性和特異性在于細菌的整個基因組作為基礎產生DNA圖譜。細菌種、株間基因特異性可通過獲得DNA片段大小及數(shù)量來確定。它對于區(qū)分親緣關

9、系近的細菌非常有效。與其它方法相比較本方法快速區(qū)別程度高不需要對基因組DNA有更深入詳細的了解?！?】AFLP(擴增片段長度多態(tài)性分析)為選擇性限制片段擴增技術先用一中等切割頻率(如EcI)和一較高切割頻率(如MseI)限制性酶消化少量純化DNA再將二個接頭(含各自的限制性位點但在接頭序列中摻入點突變在連接后原限制性位點不恢復)與基因組限制片段兩端連接然后用接頭特異引物在嚴格條件下進行PCR擴增在引物3′端有1～3個選擇性核苷酸伸入未知

10、染色體限制片段內。本法要求DNA量少且不須雜交故避免了限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)基因分型不可重復的原因———DNA部分消化和不清晰圖譜而且AFLP在實驗室內和實驗室間重復性均好可把圖譜儲存在數(shù)據(jù)庫中用于先前或今后以及實驗室間圖譜比較和鑒定新菌株。AFLP分析可用作菌種鑒定和菌株區(qū)分(90%～100%同源性為相同株60%～90%同源性為同種不同株40%～60%同源性為同屬不同種40%為不同屬)。AFLP分析具有與RFLP，RAPD等