堆肥過程中木質素降解及甲烷排放相關功能基因研究.pdf

1、堆肥化作為一種有效處理農業(yè)廢物的方法已經得到廣泛的應用，堆肥過程中微生物與有機質相互作用、相互影響，成為影響堆肥進程的關鍵因素。木質纖維素是農業(yè)廢物中的主要難降解有機物，木質素由于其結構復雜不易水解，且對纖維素和半纖維素的天然屏障作用，使得堆肥過程中木質纖維素難于降解。木質素是腐殖質形成的前體物質，因此木質素的生物降解成為堆肥過程的限速步驟。漆酶是木質素降解的三大功能酶之一，在自然界和堆肥化過程中木質素的降解中起著重要作用。傳統(tǒng)觀念認為

2、真菌漆酶在自然界中木質素降解起重要作用，最近研究發(fā)現，細菌也能產漆酶，且某些細菌漆酶具有耐熱性、耐堿性等優(yōu)良特性，這些特性有助于它們在堆肥過程的高溫、弱堿性環(huán)境中保持活性，因此可能在堆肥木質素的降解過程過程中發(fā)揮重要作用?；谝陨喜孪?，我們分析了農業(yè)秸稈堆肥化過程中潛在產漆酶細菌種群結構變化及其對理化參數的響應?；诳寺∥膸斓南到y(tǒng)發(fā)育分析結果表明，堆肥期間的細菌漆酶基因多樣性較為豐富，測得的序列與參考序列共形成13個進化枝。所測得的22

3、5個有效漆酶基因序列中與γ-proteobacteria，α-proteobacteria和Bacteroidetes相似度較高的漆酶基因序列占總數的86.2％，前兩類序列存在于分析的所有樣品中，Bacteroidetes相關序列僅降溫期樣品中沒有出現。因此，這三個類別的序列為堆肥體系中的漆酶基因優(yōu)勢類群，其編碼氨基酸很可能參與堆肥中的酚氧化酶活的合成和木質素的降解。鞘脂單胞菌目相關的序列為系統(tǒng)發(fā)育樹上最大的分枝，該類序列在所分析的5個

4、克隆文庫中均有出現，特別是在高溫期和降溫期樣品中占了非常顯著的優(yōu)勢地位。對5個堆肥樣品進行Jackknife Cluster和UniFrac PCoA分析，結果表明堆肥4個時期的樣品的分布具有明顯的階段性。Pearson和RDA多元分析結果均表明，溫度、WSC、C/N和FA與堆肥過程中細菌漆酶基因組成結構的變化呈正相關，pH和HA與堆肥細菌漆酶組成負相關。在所有的環(huán)境因子中，溫度對堆肥細菌漆酶基因結構的影響最大，另外顯著性的影響因子為H

5、A。HA與堆肥腐熟期樣品的漆酶基因分布呈正相關，這與堆肥腐熟期腐殖質的形成相對應。
　　在上一步工作基礎上，本文繼續(xù)分析了細菌、真菌和鏈霉菌漆酶基因對堆肥中木質素降解的貢獻差異，在基因水平和轉錄水平上對三類微生物漆酶基因的進行了定量。結果表明，細菌和真菌漆酶基因及其轉錄水平都遠高于鏈霉菌漆酶基因；細菌和鏈霉菌的漆酶基因及其表達量在堆肥過程中表現出相似的變化規(guī)律，高溫期具有相對較高的細菌和鏈霉菌漆酶基因及表達豐度，而真菌漆酶基因拷貝

6、數和表達量在堆肥高溫階段卻有明顯減少，表明堆體含有大量能適應堆肥環(huán)境的產漆酶細菌和鏈霉菌種群，且高溫期環(huán)境能刺激其漆酶基因的表達，但是大部分產漆酶真菌可能無法適應堆肥的高溫和弱堿性條件，導致漆酶基因豐度及其表達在高溫期有所降低。相關性分析結果表明細菌和鏈霉菌漆酶基因表達與兩個pH6.5和8.0下測得的酚氧化酶活呈顯著正相關，表明細菌和鏈霉菌是堆肥過程中酚氧化酶的合成的主要參與者。盡管細菌漆酶基因轉錄水平與酚氧化酶活呈顯著正相關關系，但是

7、與木質素降解的正相關關系不顯著，可能是因為堆肥過程中木質素的降解是由多種酶共同作用的結果，除了漆酶，許多其它的酶可能也參與了木質素的降解。真菌漆酶基因表達與木質素、半纖維素和纖維素的降解速度都呈負相關，這可能是因為真菌漆酶基因在堆肥環(huán)境下可能僅有少部分能表達并轉化為有效的酚氧化酶活，因此無法在木質素降解過程中發(fā)揮主要作用。鏈霉菌漆酶基因轉錄與木質素降解速度呈顯著正相關關系，表明堆肥過程中絕大部分鏈霉菌漆酶基因可能都表達并轉化成了有效的酚

8、氧化酶活，參與了木質素的降解。
　　除了對堆肥體系中的漆酶基因進行分子生態(tài)學研究，本文還通過分離培養(yǎng)篩選出了一株產漆酶菌株哈茨木霉（Hypocrea lixii sp. C2），通過RACE擴增出了其 cDNA全長，并將其在原核細菌中進行了表達，純化得到了漆酶蛋白，SDS-PAGE顯示條帶大小約為60 kDa。該漆酶的酶學性質顯示，純化后漆酶對多種研究底物的最適反應 pH值為4.5，漆酶在 pH<7.0的環(huán)境下相對較為穩(wěn)定，能適應

9、較大的酸性 pH范圍，在堿性環(huán)境下酶活下降很快。新漆酶最適宜反應溫度為35℃，在溫度在20～50℃范圍內漆酶酶活的變化相對平緩，而在50～70℃時，漆酶酶活下降很快。溫度與漆酶穩(wěn)定性關系的實驗結果表明新漆酶對中溫有一定適應能力，但在高溫條件下較為敏感。對Hypocrea lixii sp. C2漆酶的底物特異性與動力學進行分析，比較 ABTS、L-DOPA和愈創(chuàng)木酚三種常見漆酶底物的動力學參數。結果表明新漆酶對三種底物的Km值大小順序為

10、ABTS<愈創(chuàng)木酚愈創(chuàng)木酚>L-DOPA，表明ABTS新漆酶的最適反應底物。分析了金屬離子對漆酶活性的影響，結果表明在一定濃度的K+、Ba2+、Mg2+、Cu2+、Ca2+環(huán)境下新漆酶能保持大部分的酶活，甚至在低濃度的情況下，還能不同程度刺激漆酶的催化活性，Zn2+、Mn2+、Fe3+、Hg2+對酶有抑制作用，其中 Hg2+的抑制作用最強，濃度在8mM時，酶活僅為41.8%。Cu2+在三

11、個濃度下對漆酶酶活均有刺激作用，特別是當Cu2+濃度為8 mM時，相對酶活達到了137.6%?？疾炝?種抑制劑EDTA、NaN3、TGA、DDC和乙醇對新漆酶活性的影響，結果顯示隨著抑制劑濃度的升高，抑制作用越顯著。其中EDTA、NaN3、TGA、DDC的抑制作用非常明顯，特別是當 NaN3的濃度為20μM時，新漆酶的活性完全被抑制，而乙醇對酶活的抑制作用相對較弱。復雜的環(huán)境污染物中含有不同的金屬離子和酶抑制劑，因此，研究金屬離子和抑制

12、劑對漆酶活力的影響對于漆酶在環(huán)境污染物降解中的應用將起到重要的指導意義。
　　控制堆肥過程中甲烷等溫室氣體的排放是堆肥化處理過程中又一個重要方面。本論文比較了好氧堆肥和厭氧堆肥在處理畜禽糞便過程中的甲烷排放量，同時分析了堆肥過程中與甲烷排放相關的兩類微生物——產甲烷菌和甲烷氧化菌與甲烷排放的關系。甲烷排放分析結果表明，在50天堆置過程中好氧堆肥的CH4累計排放量明顯低于厭氧堆，約為厭氧堆的1/3，因此好氧堆肥在甲烷排放量方面是明顯

13、優(yōu)于厭氧堆的一種糞便處理方式。通過mcrA和pmoA基因分別表征產甲烷菌和甲烷氧化菌，分析產甲烷菌和甲烷氧化菌的豐度與甲烷排放之間的相關性，Pearson相關性和回歸分析結果均表明好氧堆肥堆體表面甲烷排放量與mcrA基因豐度的對數值和mcrA：pmoA的比值呈顯著線性正相關；厭氧堆堆體表面甲烷排放量與mcrA：pmoA的比值呈顯著線性正相關。這一結果佐證了我們之前的假定，即堆肥過程中甲烷的凈排放量取決于產甲烷的基因和甲烷氧化的基因之間的