人21.5kdambp微基因轉(zhuǎn)移對細胞增殖與凋亡的作用研究

1、四川大學博士學位論文人21.5 kDa MBP微基因轉(zhuǎn)移對細胞增殖與凋亡的作用研究姓名：陳建業(yè)申請學位級別：博士專業(yè)：生物化學與分子生物學指導教師：陳俊杰20030501四川大學博，{ ：論文對細胞增殖和凋亡的影響。[ 方法]1 ．M B P 、B D N F 或N G F 微基因修飾F B 、S M C 、Y T M L C 一9 0 的建立：堿裂解法提取p S C E P ．M B P —C A T 、p S V C E P - N

2、 G F - C A T 、p S V C E P ·B D N F —C A T 及p S V C E P ．C A T 質(zhì)粒D N A ，脂質(zhì)體L i p o f e e t A M I N E “介導轉(zhuǎn)染F B 、S M C 和Y T M L C ．9 0 ，經(jīng)G 4 1 8 篩選獲得M B P 、B D N F 和N G F 微基因修飾F B 、S M C 、Y T M L C - 9 0 。2 ．M B P 、B D

3、 N F 和N G F 微基因在F B 、S M C 、Y T M L C 一9 0 中表達的鑒定：0 ．2 5 ％胰蛋白酶消化收集1 ×1 0 5 個細胞，提取細胞總蛋白質(zhì)，采用W e s t e r n雜交和E L I S A 分別定性、定量檢測F B 、S M C 、Y T M L C - 9 0 中M B P 、B D N F及N G F 的異位表達，免疫細胞化學方法確定F B 、S M C 、Y T M L C -

4、9 0 中M B P的表達定位。3 ．M B P 、B D N F 和N G F 微基因修飾F B 、S M C 、Y T M L C - 9 0 細胞生長與凋亡的鑒定：各類細胞分別在轉(zhuǎn)染M B P 、B D N F 和N G F 微基因前后，采用系列技術(shù)如M T T 法檢測細胞增殖存活率，D N A 瓊脂糖電泳分析細胞D N A斷裂的梯型( L a d d e r ) 圖，T U N E L 原位熒光標記顯示單個凋亡細胞數(shù)，顯微鏡G

5、i e m s a 染色和吖啶橙熒光染色( A O ) 以及透射電子顯微鏡觀察細胞形態(tài)及其超微結(jié)構(gòu)變化，流式細胞術(shù)( F C M ) 測定細胞凋亡率；同時，檢測H 2 0 ：、腫瘤壞死因子一口( T N F - 口) 和A n t i - 蜘彈對M B P 微基因修飾F B 、S M C 、Y T M L c - 9 0 細胞增殖與凋亡的影響。[ 結(jié)果]1 ．p S C E P —M B P - C A T 、p S V C E P —

6、N G F —C A T 、p S V C E P —B D N F —C A T 及p S V C E P ．C A T質(zhì)粒D N A 的提取、酶切和表達鑒定：堿裂解法提取p S C E P —M B P —C A T 、p S V C E P —N G F - C A T 、p S V C E P - B D N F - c A T及p S V C E P ．C A T 重組質(zhì)粒D N A ，分別經(jīng)E c o R l ／H i n

7、d l l l 、S a l I ／H i n d I I I 、H i n dI I I ／B a 『I l H I 酶圖譜分析證實，含6 0 0 b p M B P 、3 9 0 b p 蘆．N G F 、7 6 0 b pB D N F c D N A 插入片段。含p S C E P —B B P - C A T 、p S V C E P ．N G F = C A T 、p S V C E P —B D N F - C A T 的