氨基菁類乏氧熒光探針的合成和性能研究.pdf

1、乏氧（Hypoxia）作為惡性腫瘤的特征之一，在腫瘤的生長調(diào)控中扮演著重要的角色。研究腫瘤乏氧可以對腫瘤的檢測與治療提供更加有力的手段，而在眾多乏氧檢測技術中，小分子熒光探針由于其設計簡單、響應靈敏等優(yōu)勢被廣泛用于腫瘤乏氧的檢測。硝基還原酶（NTR）在腫瘤乏氧細胞內(nèi)往往會大量表達，因此其可以作為檢測腫瘤乏氧的重要指標。目前基于硝基還原酶的乏氧探針有很多，但近紅外熒光探針卻并不多見，尤其是吸收和發(fā)射均在近紅外區(qū)域（>700 nm）的乏氧熒

2、光探針。另外，基于氨基菁類熒光染料的近紅外乏氧探針更是少有報道，因此設計合成新型的近紅外乏氧探針是在現(xiàn)有研究基礎上的一個有力補充，也能更好地推動熒光探針在生物成像上的應用。本文對現(xiàn)有的乏氧熒光探針做了一個簡單的綜述，然后在現(xiàn)有的研究基礎上設計合成了一系列新型的近紅外乏氧熒光探針，并研究了其在乏氧成像方面的應用。
　　本文首先以對硝基芐基作為乏氧標記物、以哌嗪橋連取代的氨基菁類熒光染料CyNP為母體設計合成了兩類檢測硝基還原酶的近紅

3、外乏氧熒光探針CyNP1和CyNP2，并通過質(zhì)譜和 HPLC檢測驗證了探針對硝基還原酶的響應機理。CyNP1在緩沖溶液中的熒光淬滅非常徹底，而在硝基還原酶和NADH的作用下，CyNP1在10分鐘之內(nèi)就能迅速恢復大部分熒光，總的熒光增強能達到近40倍；而CyNP2對硝基還原酶響應之后只有2.5倍的熒光增強，而且熒光增強之后還會有輕微的減弱。質(zhì)譜和HPLC結果顯示，CyNP1對硝基還原酶響應并生成氨基化合物之后會發(fā)生重排-消除反應并最終生成

4、母體染料CyNP，而CyNP2則只能生成硝基還原過程中的一個中間體亞硝基化合物。因此對比兩類探針，CyNP1顯示出更加優(yōu)異的硝基還原酶檢測能力。另外，探針CyNP1在其它還原性物質(zhì)存在下均沒有明顯的熒光變化，表現(xiàn)出了對硝基還原酶的特異性響應。在細胞成像實驗中，CyNP1在乏氧條件和常氧條件下的細胞成像圖有著非常明顯的區(qū)別，其中常氧條件下的Hela細胞幾乎檢測不到熒光，而Hela細胞在乏氧條件下培養(yǎng)之后卻能檢測到明顯的熒光。當在乏氧細胞中

5、加入一種硝基還原酶的抑制劑-雙香豆素之后，乏氧細胞內(nèi)完全檢測不到熒光。這些結果表明 CyNP1可以很好的用于硝基還原酶和腫瘤乏氧的檢測。
　　為了探索波長更長的近紅外乏氧探針，本文又以對硝基苯甲?；鳛榉ρ鯓擞浳?、以氨基菁類熒光染料為母體設計合成了兩類近紅外乏氧探針CyN1和CyNP3，并首次通過質(zhì)譜檢測探討了硝基還原酶對硝基類乏氧探針的催化還原機理。兩類探針的最大吸收波長和發(fā)射波長均在700 nm以上的近紅外區(qū)域，其中CyN1的

6、最大發(fā)射更是達到了800 nm以上，是目前報道的熒光增強型乏氧探針中吸收和發(fā)射波長最長的熒光探針。兩類乏氧探針均對硝基還原酶有明顯的熒光響應，熒光增強都能達到5倍左右，其中CyNP3對硝基還原酶響應十分迅速，5分鐘之內(nèi)基本能恢復大部分熒光。另外質(zhì)譜結果顯示，硝基還原酶對硝基類乏氧探針的催化還原過程主要涉及三類化合物，包括亞硝基化合物、羥胺類化合物以及氨基化合物，而探針CyN1和CyNP3的熒光增強主要來自催化還原過程的中間產(chǎn)物亞硝基化合