微流控凝膠氣液界面的構(gòu)建及在卷煙煙氣細(xì)胞毒性、氧化應(yīng)激檢測中的應(yīng)用.pdf

1、全煙氣暴露下的體外毒理學(xué)研究，對卷煙煙氣危害性評價及其毒性作用機制研究具有重要意義。本文結(jié)合微流控技術(shù)，在芯片上構(gòu)建氣液界面，模擬人體肺部細(xì)胞暴露在煙氣環(huán)境中的實際狀態(tài)，實現(xiàn)了芯片上煙氣細(xì)胞毒性及氧化應(yīng)激作用的原位高通量檢測。主要研究內(nèi)容如下所示：
　　一、微流控凝膠氣液界面煙氣暴露芯片的構(gòu)建
　　研究構(gòu)建了一種“三明治結(jié)構(gòu)”氣液界面細(xì)胞培養(yǎng)和煙氣暴露芯片，上層為煙氣暴露層，中間層為凝膠細(xì)胞培養(yǎng)陣列層，下層為液體管道層。

2、r>　　上層芯片采用激光雕刻技術(shù)制得芯片模板，再由聚二甲基硅氧烷（PDMS）倒模而成。該層利用氣體的自由擴散形成氣體梯度，CO2和溴百里酚藍(lán)酸堿指示劑表征結(jié)果證實上層芯片的不同通道中可形成良好的氣體梯度，線性方程為：y=32.85x-30.55，R2=0.9936。
　　中間層芯片首先使用激光雕刻機雕刻聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）板得到孔陣列芯片，然后使用凝膠進行細(xì)胞裝載。由于具有較好的機械穩(wěn)定性和滲透性，凝膠可以為細(xì)胞生長提供穩(wěn)

3、定的生長環(huán)境，凝膠和溶液之間的快速交換，保證了細(xì)胞生長所需要的營養(yǎng)和細(xì)胞代謝廢物的及時排出。使用該凝膠氣液界面芯片，連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48 h，通過AO-EB熒光染色發(fā)現(xiàn)細(xì)胞存活率在95％以上，證實該芯片可用于細(xì)胞的長期培養(yǎng)。
　　下層芯片利用光刻技術(shù)制得芯片模板，再由聚二甲基硅氧烷（PDMS）倒模而成。基于芯片的“圣誕樹結(jié)構(gòu)”管道，液體相互擴散混合可形成液體梯度，超純水和紅色液體進行的梯度表征結(jié)果證實下層芯片不同通道中可形成良好的液體

4、梯度，線性方程為：y=34.02x-36.43，R2=0.9929。
　　二、芯片上煙氣暴露與細(xì)胞毒性檢測
　　利用構(gòu)建的微流控凝膠氣液界面煙氣暴露芯片，以肺腺癌細(xì)胞A549為模型，開展了不同氣、液梯度條件下的細(xì)胞毒性研究。研究結(jié)果表明：1）細(xì)胞存活率隨煙氣流速和暴露時間的增加而降低；在流速為20 mL/min，暴露時間為20 min的條件下，細(xì)胞存活率在芯片的不同通道中呈梯度變化，由95%降到65%，即細(xì)胞存活率與煙氣呈劑

5、量-效應(yīng)關(guān)系；2）細(xì)胞存活率隨下層 H2O2暴露濃度和暴露時間的增加而降低；在H2O2濃度為50 mM，刺激時間為2 h的條件下，細(xì)胞存活率在芯片的不同通道中呈梯度變化，由95%降到70%，即細(xì)胞存活率與H2O2呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。該研究結(jié)果進一步證實了構(gòu)建的氣液界面細(xì)胞培養(yǎng)和煙氣暴露芯片可實現(xiàn)氣、液雙梯度。
　　三、芯片上煙氣暴露與細(xì)胞氧化應(yīng)激作用
　　利用構(gòu)建的微流控凝膠氣液界面煙氣暴露芯片，以肺腺癌細(xì)胞A549為模型，開