實時熒光單引物等溫擴增技術檢測牛乳中的金黃色葡萄球菌的研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），它是一種革蘭氏染色陽性菌。廣泛的存在于自然界中，可以引發(fā)人和動物的感染疾病。比如說局部化膿性炎癥和全身感染，同時也是醫(yī)院非常常見的感染病原體之一。金黃色葡萄球菌不僅能夠引起感染，而且可以產(chǎn)生腸毒素，還會引起食品污染從而導致食物中毒。目前發(fā)現(xiàn)，疾病的爆發(fā)與牛乳息息相關。當前，我們用于檢測金黃色葡萄球菌的方法有:紅外分光分析技術、酶聯(lián)免疫法(ELISA)、PCR方法。但是這些常規(guī)

2、的檢測手段過程復雜且繁瑣，實驗所需要的時間也比較長，同時也并沒有好的特異性以及靈敏度;免疫學方法檢測出的特異性和靈敏度相較于傳統(tǒng)常規(guī)的檢測方法有所改善但仍然達不到我們的期望值，并且相差較遠。所以，建立一種高效靈敏的檢測金葡菌的方法已經(jīng)迫在眉睫。實時熒光單引物等溫擴增技術(RF-SPIA)是近幾年來一種新興的核酸擴增技術利用實時熒光檢測系統(tǒng)通過檢測熒光信號從而監(jiān)測反應進度。反應結束后，自動判定結果的陰性和陽性，對擴增的結果直觀清晰的表達出

3、來。因此，這種方法可以快速檢測食源性致病菌。
　　本文利用在線軟件DNAMAN和Premier5.0對金黃色葡萄球菌(CMCC26073)的特異性基因nuc設計了一條特異性強的引物，對dNTPs濃度，Mg2+濃度，擴增溫度等實驗條件進行優(yōu)化，最終的實驗反應體系為25μL:滅菌DEPC水12μL，dNTPs0.2 mM(10 mM),2×Bca Buffer2.0μL,5×RNaseH Buffer2.0μL，單引物0.8μM,模板

4、1.5μL, Bovine Serum Albumin(BSA)0.4 mg/mL(20 mg/mL) SYBRGreenⅡ(1∶400)0.5μL Recombinant at RNase Inhibitor0.5 U/μL, Mg2+0.5 mM(25 mM), BcaDNA聚合酶0.4 U/μL（20 U/μL），核糖核酸酶RNaseH1.2 U/μL(60 U/μL)，blocker0.2 mM。反應體系:將混合好的溶液經(jīng)95℃

5、，80 s預變性處理后降溫至60℃，迅速加入RNaseH酶和Bca DNA聚合酶，在實時熒光檢測器上60℃，反應時間為120 min。反應過程中通過監(jiān)測熒光信號的強度，來確定最合適的反應條件，建立金黃色葡萄球菌實時熒光SPIA檢測方法。
　　本文對6株金黃色葡萄球菌和其他17株不同的致病菌進行特異性實驗研究，實驗得出6株金黃色葡萄球菌檢測結果為陽性，其他17株菌均非金黃色葡萄球菌檢測結果均為陰性。由此證明試驗所設計的引物特異性高。

6、本實驗研究了實時熒光單引物等溫擴增技術檢測金黃色葡萄球菌純培養(yǎng)物的靈敏度和人工污染牛乳的檢出限。實驗結果表明實時熒光單引物等溫擴增技術檢測金黃色葡萄球菌純培養(yǎng)物的靈敏度為2.0×101 CFU/mL，金黃色葡萄球菌人工污染牛乳中的檢出限為6.0×101 CFU/mL。RF-SPIA技術比傳統(tǒng)的方法的靈敏度要高很多，不僅提高了反應效率，還大大縮短了時間。
　　由研究結果可知，本實驗所建立的實時熒光單引物等溫擴增技術檢測牛乳中的金黃色