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文檔簡介
1、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)廣泛分布于自然界中,因此,該菌很容易污染食品,嚴(yán)重的甚至?xí)斐墒澄镏卸?金黃色葡萄球菌也是引發(fā)臨床性疾病的主要病原微生物,當(dāng)前已有的常規(guī)檢測方法耗時長、需要專門的儀器設(shè)備或?qū)I(yè)人才,不利于該菌的快速檢測,因此,針對該菌建立一種快速、靈敏的檢測方法具有非常重要的現(xiàn)實意義,也將為解決當(dāng)今食品安全問題提供重要的技術(shù)支持。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法(LAMP)能夠高效、快速、準(zhǔn)確、靈敏的檢測核酸,
2、但該技術(shù)在檢測過程中易產(chǎn)生假陽性結(jié)果,從而限制該技術(shù)的廣泛應(yīng)用。本文建立了環(huán)介導(dǎo)等溫擴增-單分子信標(biāo)方法,快速、準(zhǔn)確地檢測金黃色葡萄球菌,并對該方法及其檢測特異性、靈敏度等方面進行了研究。
本實驗確定了金黃色葡萄球菌培養(yǎng)方法、作出了金黃色葡萄球菌的生長曲線,確定了對數(shù)生長周期,并對該菌進行了平板計數(shù),為后續(xù)LAMP及SMB-LAMP檢測方法的靈敏度確定提供了定量結(jié)果;通過選取不同的試驗方法提取DNA,測定并計算出各種提取方法所
3、得DNA的OD260/OD280,然后用瓊脂糖凝膠電泳進行驗證實驗,最終確定金黃色葡萄球菌基因組DNA的最優(yōu)提取方法為改良型SDS法;選取金黃色葡萄球菌特異性基因—耐熱核酸酶基因nuc作為本實驗中LAMP擴增的靶序列,并根據(jù)該基因的保守序列在線設(shè)計了一套LAMP擴增引物;對該引物的LAMP反應(yīng)條件進行優(yōu)化,結(jié)果得出:LAMP反應(yīng)最適溫度為60℃,最佳反應(yīng)時間為45min,dNTPs最佳反應(yīng)濃度為1.4mmol/L,加入環(huán)引物比未加環(huán)引物
4、的體系反應(yīng)快15min;針對所設(shè)計的LAMP引物,選取金黃色葡萄球菌2株、大腸桿菌3株、釀膿鏈球菌1株、沙門氏菌1株進行同步檢測,結(jié)果只有金黃色葡萄球菌顯示陽性,證明了該引物具有良好的特異性;針對提取的DNA模板進行濃度梯度稀釋,分別標(biāo)記:100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6,同時,針對隔夜培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌液逐漸進行10倍濃度梯度稀釋,然后應(yīng)用改良型SDS法對稀釋液分別進行DNA提取,最后對上述兩種方法
5、獲得的DNA分別進行LAMP擴增,結(jié)果證明,LAMP檢測金黃色葡萄球菌的檢測限為100fgDNA或者100CFU/tube,其靈敏度要比PCR檢測該菌的靈敏度高出100倍。
在建立的最佳LAMP反應(yīng)條件基礎(chǔ)上,結(jié)合單分子信標(biāo)(SMB),對金黃色葡萄球菌進行了快速、準(zhǔn)確的檢測,選定SMB-LAMP的反應(yīng)條件為上述LAMP優(yōu)化后的最終結(jié)果,并且選定分子信標(biāo)beacon為0.8μM。為了驗證該反應(yīng)(SMB-LAMP)的特異性,利用金
6、黃色葡萄球菌2株、大腸桿菌1株以及沙門氏菌1株,對所設(shè)計的單分子信標(biāo)進行了驗證實驗,最后確定根據(jù)金黃色葡萄球菌nuc基因所設(shè)計的單分子信標(biāo)具有較高的特異性;同時,對所建立的SMB-LAMP法檢測金黃色葡萄球菌的靈敏度進行了確定,最終顯示,以金黃色葡萄球菌DNA濃度梯度為SMB-LAMP反應(yīng)模板時最低檢測限為50fg,而以金黃色葡萄球菌液濃度梯度稀釋液提取DNA為模板時,最低檢測限為6CFU/tube,說明SMB-LAMP較單純的LAMP
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