高粱原花青素四聚體與變形鏈球菌血清型c致齲毒力因子作用的光譜學研究.pdf

1、齲齒是一種發(fā)生率很高的口腔疾病，由于目前常用的干預齲齒的方法、制劑等都存在一定的缺陷，促使人們希望從天然產物中尋求新的高效、無毒副作用的干預齲齒的活性成分。據研究報道，植物多酚類化合物能夠有效保護口腔健康，而原花青素是以兒茶素或表兒茶素為結構單元縮合而成的多酚類聚合物，其對齲齒的干預效果比如今公認的抗齲制劑茶多酚更好，但是關于原花青素干預致齲菌在牙齒表面粘附的途徑和作用機制尚未研究清楚。變形鏈球菌（Streptococcus mutan

2、s，S.mutans）作為口腔中最主要的致齲齒菌之一，其在牙面上的粘附和定植是齲齒發(fā)生的關鍵，而粘附的實質則是致齲齒菌表面粘結素與牙齒表面唾液獲得性膜上的受體蛋白相互作用的結果。葡糖基轉移酶(GTFs)和葡聚糖結合蛋白(GBPs)是S.mutans產生的重要致齲毒力蛋白，且兩者是S.mutans表面粘結素中的主要成分。GTFs在S.mutans（Ingbrittc）中主要分為三種，分別是GTFB，GTFD和GTFC，其中GTFB能夠催化

3、蔗糖產生水不溶性葡聚糖，這一過程對S.mutans在牙面粘附形成菌斑至關重要，gtfB的基因全長約為4.8 kb，其中位于N端的催化活性區(qū)(CAT)是gtfB三個功能區(qū)段中最重要的區(qū)段。S.mutans(Ingbritt c)有4種GBPs，分別是GBPA、GBPB、GBPC和GBPD。GBPB是S.mutans在牙齒表面粘附與聚積的“橋梁”，其除了具有結合葡聚糖的功能之外，還可能與S.mutans細胞壁的形成以及其肽聚糖水解酶的活性相

4、關。本文將從高粱外種皮中分離得到的原花青素四聚體作為研究干預齲齒的天然活性成分，通過基因克隆表達技術分別得到高純度、高活性的GTFB/CAT蛋白和GBPB-sumo蛋白，并采用熒光猝滅、紫外-可見吸收光譜和圓二色譜三種常見的光譜學技術研究GTFB/CAT和GBPB-sumo兩種蛋白分別與SPC四聚體相互作用前后的結構及活性變化，期望揭示SPC四聚體分別與GTFs和GBPs相互作用并干預S.mutans在牙齒表面粘附的作用機制。本研究主要

5、內容包括：
　　⑴高粱外種皮中原花青素四聚體的分離及鑒定。采用RP-HPLC-ESI-MS/MS對SPC-Ⅵ級分進行鑒定，分析結果表明SPC-Ⅵ級分主要由原花青素四聚體組成。
　?、破咸烟腔D移酶B催化活性區(qū)的基因克隆及表達。根據NCBI上公布的Streptococcus mutans UA159(Ingbrittc)gtfB的cDNA序列，按照其兩端序列設計引物，采用PCR克隆技術釣取S.mutans UA159的gtfB

6、/CAT基因，PCR產物經測序鑒定后連接表達載體pET-28b(+)，將重組體pET-28b(+)-GTFB/CAT轉入大腸桿菌BL21中進行誘導表達，比較發(fā)現(xiàn)當誘導劑異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的濃度為1mmol/L時，在37℃或30℃下誘導4h表達效果更好。表達產物經Ni2+-NAT樹脂親和層析純化得到不可溶的GTFB/CAT包涵體蛋白，并經變性-復性恢復其可溶性，最終產物經SDS-PAGE鑒定其純度約為80％，So

7、mogyi法測得GTFB/CAT蛋白的酶活和比酶活分別為131.67 mIU和1.66 IU/mg。將通過基因克隆表達得到的蛋白經Nano LC-MS/MS鑒定，其中包含3種可信蛋白，均來自Streptococcus mutans serotype C(Strain ATCC700610/ua159)，得分最高的來源于gtfB的蛋白為目標蛋白。
　?、瞧咸烟墙Y合蛋白B的基因克隆與表達。根據NCBI上公布的S.mutans UA15

8、9(Ingbrittc)gbpB的cDNA序列，按照大腸桿菌的偏好優(yōu)化密碼子并在體外進行gbpB全基因的合成。將經測序鑒定的PCR克隆產物連入pET-28a-sumo表達載體，將重組表達質粒pET-28a-sumo-gbpB轉化至表達感受態(tài)細胞Rosetta(DE3)中，在IPTG的濃度為0.5 mmol/L，37℃，158 r/min條件下誘導3h。將表達得到的蛋白上清液和蛋白沉淀分別經SDA-PAGE檢測，在表達上清液中發(fā)現(xiàn)目標蛋白

9、，將裂解的蛋白上清液用Ni2+-NTA親和層析純化后經SDS-PAGE檢測，得到蛋白純度約為90％。將基因克隆得到的GBPB-sumo蛋白經Nano LC-MS/MS鑒定，其中3種可信蛋白均來源于Streptococcus mutans serotype C(Strain ATCC700610/ua159)，得分最高的來源于gbpB的蛋白為目標蛋白。
　?、热N光譜學方法研究SPC四聚體分別與GTFB/CAT和GBPB-sumo蛋

10、白相互作用的機理。Somogyi法測得GTFB/CAT蛋白與SPC四聚體相互作用前后的酶活值分別為131.67mIU和7.59 mIU，酶活降低了94.24％，表明SPC四聚體和GTFB/CAT蛋白相互作用后抑制了其酶活。通過熒光猝滅分析得到，SPC四聚體對GTFB/CAT蛋白、GBPB-sumo蛋白的Stern-Volmer猝滅常數(shù)KSV分別為2408.1 M-1和2346.6 M-1，猝滅速率常數(shù)kq分別為2.4081×1011M-

11、1·s-1和2.3466×1011 M-1·s-1，同時SPC四聚體與兩種蛋白之間的結合常數(shù)KA分別為1522.6M-1和2618M-1，結合位點數(shù)n均為1，根據熒光猝滅發(fā)生機理推斷SPC四聚體與GTFB/CAT蛋白、GBPB-sumo蛋白之間形成了不發(fā)熒光的復合物，猝滅方式是單一的靜態(tài)猝滅。GTFB/CAT蛋白和GBPB-sumo蛋白的紫外圖譜隨著SPC四聚體濃度的增大也發(fā)生改變，其吸光強度均隨著SPC四聚體濃度的增大而發(fā)生明顯地變化

12、，且最大吸收峰的位置發(fā)生了不同程度的紅移，說明SPC四聚體對蛋白質中芳香族氨基酸殘基所處的微環(huán)境造成了影響。紫外-可見吸收光譜的結果進一步說明了SPC四聚體對GTFB/CAT蛋白、GBPB-sumo蛋白均是單一的靜態(tài)猝滅過程。經圓二色光譜分析發(fā)現(xiàn)GTFB/CAT蛋白和GBPB-sumo蛋白的二級結構均因與SPC四聚體的結合而發(fā)生改變，其中GTFB/CAT蛋白的二級結構中不含β-轉角，隨著SPC四聚體的濃度不斷增大，α-螺旋和無規(guī)則卷曲結

13、構的百分比逐漸下降至0.00％，β-折疊的百分比則均增加至100.00％。GBPB-sumo蛋白的二級結構除了與GTFB/CAT蛋白有相似的結構變化外，其二級結構中的β-轉角的百分比也減小至0.00％。由此推斷SPC四聚體與兩種蛋白之間均發(fā)生了結合，使蛋白內維持結構穩(wěn)定性的氫鍵遭到破壞，且其內部疏水區(qū)域的一些氨基酸殘基可能被暴露出來，從而導致蛋白的二級結構發(fā)生改變。SPC四聚體使兩種致齲蛋白結構或活性發(fā)生改變，從而影響了S.mutans