池蝶蚌親環(huán)蛋白D(CypD)基因的表達(dá)及對(duì)人肝癌細(xì)胞(SMMC-7721)生長(zhǎng)的影響.pdf

1、本研究以淡水貝類池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)為研究對(duì)象，用HsCypD基因完整的ORF與pGEX-4T1構(gòu)建重組載體，將重組質(zhì)粒pGEX-4T1-HsCypD轉(zhuǎn)化E.coil BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，然后進(jìn)行原核表達(dá)，后經(jīng)小量誘導(dǎo)以確定IPTG濃度及溫度等表達(dá)條件，成功表達(dá)出分子量約為67kDa的GST-HsCypD融合蛋白。利用GST親和層析獲得單一GST-HsCypD融合蛋白后，用凝血酶切除融合蛋白的G

2、ST標(biāo)簽，再用GST親和層析去掉切下的GST標(biāo)簽，從而獲得純度較高的分子量約為41kDa左右的HsCypD蛋白。采用Bradford法用于測(cè)定蛋白濃度及含量，將符合抗體制備濃度要求的HsCypD作為抗原來免疫長(zhǎng)耳朵兔，制備多克隆抗體。利用ELISA間接法來檢測(cè)所得抗體的效價(jià)，結(jié)果效價(jià)高達(dá)1:1024000。Western blot檢測(cè)結(jié)果表明得到的多克隆抗體不僅能與作為免疫抗原的HsCypD有較好的特異性結(jié)合，對(duì)于從池蝶蚌中提取的腸、肝

3、以及性腺的組織蛋白，也同樣具有較強(qiáng)的特異性結(jié)合，說明本研究獲得的確實(shí)是針對(duì)HsCypD特異性結(jié)合的抗體，為后續(xù)關(guān)于HsCypD的生物功能的相關(guān)研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　此后本研究利用HsCypD的抗體，通過免疫熒光定位技術(shù)來探究HsCypD在池蝶蚌的肝胰腺細(xì)胞和雌性性腺細(xì)胞中的位置。結(jié)果表明，在這些組織細(xì)胞中，HsCypD在細(xì)胞質(zhì)上的熒光強(qiáng)度很明顯。為了進(jìn)一步確定HsCypD在細(xì)胞中的顯微定位，本研究成功構(gòu)建pEGFP-C1-Hs

4、CypD真核載體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染于人肝癌細(xì)胞(SMMC-7721)，表達(dá)后經(jīng)過激光共聚焦顯微鏡觀察，結(jié)果證實(shí)HsCypD在細(xì)胞中主要存在于細(xì)胞質(zhì)中。本次蛋白定位同以前關(guān)于HsCypD的生物信息學(xué)相關(guān)分析的結(jié)論相一致，我們推測(cè)該蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)中行使相關(guān)的功能。
　　為了檢測(cè)HsCypD對(duì)肝癌細(xì)胞(SMMC-7721)生長(zhǎng)的影響，將構(gòu)建好的pcDNA3.1(+)-HsCypD以及pcDNA3.1(+)空載質(zhì)粒，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SMMC-7721細(xì)

5、胞。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，分別提取未經(jīng)處理的空白對(duì)照組，轉(zhuǎn)染空載的空載對(duì)照組，以及實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA作為模版，對(duì)HsCypD、p53、Bax、Bcl2和Caspase-3基因的表達(dá)做實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。結(jié)果表明，相對(duì)于空載對(duì)照組，HsCypD過表達(dá)組中促凋亡基因p53、Bax、Caspase-3均有下調(diào)，而抑制凋亡基因Bcl2有大幅度的上調(diào)。后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染了30個(gè)小時(shí)的三組細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于空

6、載對(duì)照組的凋亡率有明顯的降低，說明HsCypD的過表達(dá)能夠減弱pcDNA3.1(+)空載表達(dá)造成的細(xì)胞凋亡影響，具有一定的抑制細(xì)胞凋亡的功能。將pcDNA3.1(+)-HsCypD和pcDNA3.1(+)分別轉(zhuǎn)染SMMC-7721細(xì)胞24小時(shí)后，加入不同濃度梯度的阿霉素刺激8小時(shí)，利用Caspase-3分光光度法檢測(cè)試劑盒來檢測(cè)在不同條件下細(xì)胞的caspase-3活化程度。結(jié)果表明，HsCypD的過量表達(dá)能夠抑制阿霉素誘導(dǎo)的caspas