組織蛋白酶K在牙體硬組織形成中的作用研究.pdf

1、組織蛋白酶K（cathepsin K，CTSK）于1995年首先被發(fā)現(xiàn)存在于兔的破骨細胞中。早先的研究認為CTSK主要在破骨細胞中表達，并通過在酸性環(huán)境下降解Ⅰ型膠原、骨橋蛋白等骨基質蛋白參與破骨細胞介導的骨吸收。CTSK基因位于人類1號染色體，其突變將導致致密性成骨不全（pycnodysostosis）。其典型癥狀除骨密度增高、頻發(fā)骨折、指/趾骨末端溶骨等骨骼異常之外，通常還會表現(xiàn)有牙釉質發(fā)育障礙、牙髓腔或根管閉鎖以及牙骨質增厚等牙體

2、硬組織異常，但其機制尚不清楚，甚至目前尚未見到CTSK在牙齒發(fā)育過程中表達模式及作用的研究報道?？紤]到骨組織和牙體硬組織（牙釉質、牙本質和牙骨質）有著相似的成分及理化性質，在骨改建過程中發(fā)揮重要作用的CTSK有可能在牙體硬組織發(fā)育過程中亦發(fā)揮重要作用。本課題以研究CTSK在牙齒發(fā)育過程中的表達模式為切入點，利用體外降解實驗尋找CTSK在牙齒發(fā)育過程中可能的作用底物，構建Ctsk基因敲除小鼠模型并分析其表型，并通過對CTSK基因突變臨床病

3、例的研究，來探索CTSK在牙體硬組織形成中的作用，為進一步研究其在牙齒發(fā)育中的作用機制奠定基礎。
　　方法：
　　1)25只BALB/c小鼠（18天胎鼠和出生后1天、5天、10天、20天小鼠各5只），用1％戊巴比妥鈉行腹腔內注射過量麻醉處死后解剖分離下頜骨，利用免疫組化染色觀察下頜磨牙（牙胚）中CTSK的表達情況；
　　2)利用釉基質蛋白（Emdogain，EMD）酶譜實驗（考馬斯亮藍染色），檢測不同pH值（pH=4.

4、5、pH=5.5和pH=8）、不同反應時間（2h、6h、12h、24h、48h）和不同CTSK濃度（上樣量分別為0.015μg、0.045μg、0.075μg、0.105μg、0.15μg和0.225μg）條件下，CTSK對釉基質蛋白的降解能力；
　　3)利用體外降解實驗（銀染色），檢測不同酶/底物比和不同反應時間（0h、2h、4h、8h、12h、24h、36h、48h）條件下，CTSK對釉原蛋白（AMELX）的降解能力；

5、　　4)委托上海南方模式生物科技發(fā)展有限公司，利用CRISPR/Cas9技術構建Ctsk基因敲除小鼠模型；
　　5)利用體視顯微鏡和Micro CT初步觀察Ctsk基因敲除小鼠下頜骨和牙齒的形態(tài)與結構；
　　6)通過病史采集、體格檢查、病理檢查、X線檢查、頜面部CBCT等檢查和CTSK基因測序對1例致密性成骨不全患者進行臨床研究和基因分析。
　　結果：
　　1)在小鼠磨牙牙胚發(fā)育過程中，從前成釉細胞到成熟晚期的成

6、釉細胞均表達CTSK，表達強度呈弱-強-弱的變化；
　　2)在牙本質礦化階段的成牙本質細胞中可以檢測到CTSK的強表達，并且這種表達一直持續(xù)到牙本質形成的晚期；
　　3)通過EMD酶譜實驗，發(fā)現(xiàn)在pH=4.5的酸性環(huán)境中，CTSK能夠降解商品化的釉基質蛋白，其酶解能力隨著作用時間和CTSK濃度的增加而增強；
　　4)通過體外降解實驗，發(fā)現(xiàn)CTSK可以將釉原蛋白裂解為多個產(chǎn)物，其酶解能力隨著作用時間和CTSK濃度的增加而

7、增強；
　　5)成功構建了Ctsk-/-小鼠模型，為研究CTSK在牙齒發(fā)育中的作用及作用機制提供了實驗工具；
　　6)初步觀察到Ctsk-/-小鼠磨牙有類似于成熟不全型釉質發(fā)育不全的表現(xiàn)，以及下頜第一磨牙髓室牙本質增厚、髓室局部閉鎖等牙體硬組織異常表現(xiàn)；
　　7)通過體格檢查、影像學檢查、病理檢查等，發(fā)現(xiàn)該患者具有身材矮小、骨密度增高、鎖骨發(fā)育異常、雙手雙腳短小、指甲發(fā)育異常、指/趾骨末端溶骨、額骨膨隆、顴面部塌陷、上

8、下頜骨發(fā)育不良、下頜角變鈍、腭穹隆消失、上頜牙列缺損、下頜牙列缺失、牙骨質增生、牙齒萌出異常、下頜頜骨骨髓炎等致密性成骨不全的典型癥狀；通過基因分析，明確了患者致密性成骨不全的診斷，發(fā)現(xiàn)了CTSK基因5號外顯子上的兩個復合雜合突變位點（p.Gly146Asp和p.Tyr203His）。
　　結論：本課題首次發(fā)現(xiàn)了CTSK表達于小鼠磨牙牙體硬組織形成相關細胞，首次揭示了CTSK在小鼠磨牙發(fā)育過程中的時空表達模式及CTSK能夠降解牙體

9、硬組織特異性蛋白——釉原蛋白等釉基質蛋白的能力；成功構建了Ctsk-/-小鼠模型，為進一步研究CTSK在牙齒發(fā)育中的作用及作用機制提供了實驗工具；并且首次觀察到Ctsk-/-小鼠磨牙具有釉質發(fā)育不全、局部髓室閉鎖等牙體硬組織異常表現(xiàn)。與此同時，我們再一次證實CTSK基因突變所致的致密性成骨不全患者表現(xiàn)有包括牙齒發(fā)育異常在內的多種牙齒相關表征。初步證實了CTSK在牙體硬組織形成過程中發(fā)揮作用，為進一步揭示CTSK在牙體硬組織形成過程中的作