組織蛋白酶B在棉鈴蟲幼蟲血細胞中的表達研究.pdf

1、蛋白水解酶(protease)是催化多肽或蛋白質(zhì)水解的酶的統(tǒng)稱，簡稱蛋白酶。廣泛分布于動物、植物及微生物中，種類繁多。蛋白酶對機體的新陳代謝及生物調(diào)控具有重要作用。蛋白酶按水解肽鏈的部位可分為內(nèi)肽酶(EC3.4 2-24，99)及外肽酶(EC3.411-19)。根據(jù)各種內(nèi)肽酶作用位點的催化基團又可將之分為四大類，分別為絲氨酸蛋白酶，半胱氨酸蛋白酶，天冬氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶。 一組織蛋白酶(cathepsin，Cath．)是一大

2、類對有機體的生命活動非常重要的半胱氨酸蛋白酶。組織蛋白酶通常指在酸性環(huán)境中被活化的蛋白水解酶。正常狀態(tài)下，組織蛋白酶位于溶酶體，并可非特異性水解多種蛋白質(zhì)提供有機體需要的氨基酸和能量。還可以參與有機體的其他生理活動，如骨質(zhì)吸收和細胞凋亡等。如果組織蛋白酶異常表達，它們也可以引起病理反應(yīng)。如通過降解細胞外基質(zhì)蛋白，加速腫瘤細胞的遷移和擴散。 昆蟲體內(nèi)也有大量的組織蛋白酶分布，其中常見的為Cath．B、Cath．D和Cath．L，表

3、達和分布部位多見于脂肪體組織、幼蟲的消化道、早期胚胎、卵母細胞及幼蟲的血細胞等。功能與昆蟲的卵母細胞發(fā)生、早期胚胎發(fā)育、食物消化以及變態(tài)過程中組織的解體和重建有關(guān)。 棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)屬鱗翅目夜蛾科，是一種分布廣泛、危害嚴重的農(nóng)業(yè)害蟲。本實驗室已從棉鈴蟲卵中鑒定并純化出棉鈴蟲組織蛋白酶B(H．a(chǎn)rmigera cathepsin B，HCB，EC 3.4.22.1)，并克隆了該酶的全長cDNA(G

4、enBank AF222788)。HCB屬于半胱氨酸類蛋白酶，酶原的分子量約為37kDa，成熟酶的分子量約為30kDa。該酶的最適pH為3.0-4.0，活性可以被半胱氨酸蛋白酶抑制劑反一環(huán)氧琥珀酰－L－白氨酰－(4－胍基)-丁烷(E－64)抑制。在此基礎(chǔ)上，還進行了HCB的體外表達研究，制備了抗HCB的單克隆抗體，并進行了該酶的底物特異性和組織分布研究。已證實該酶參與了棉鈴蟲胚胎發(fā)育過程中卵黃蛋白水解、成蟲脂肪體凋亡等生命活動，但對其在

5、幼蟲血細胞中的表達分布以及功能尚未進行研究。 本文在實驗室原有工作的基礎(chǔ)上，對HCB在棉鈴蟲幼蟲血細胞中的表達分布和功能進行了初步研究。首先對棉鈴蟲幼蟲血細胞進行了分類鑒定。利用吖啶橙和二碘化丙錠熒光染色法，微分干涉顯微鏡觀察法，結(jié)合吉姆薩染色法在棉鈴蟲幼蟲血淋巴中鑒定出5種類型的血細胞，分別是原血細胞、漿血細胞、粒血細胞、珠血細胞和類絳色細胞，詳細描述了其形態(tài)結(jié)構(gòu)特征，同時也觀察到類絳色細胞體外排核的過程及漿血細胞體外黏附鋪展

6、等細胞行為。在血細胞分類的基礎(chǔ)上，對HCB在棉鈴蟲幼蟲血細胞中的表達進行了研究。利用Northern blot研究發(fā)現(xiàn)HcB在血細胞中的轉(zhuǎn)錄具有發(fā)育階段特異性，在6齡48h幼蟲血細胞中HCB mRNA表達量最高；Western blot實驗發(fā)現(xiàn)HCB在血細胞中的翻譯也具有發(fā)育階段特異性，6齡96h幼蟲血細胞中HCB蛋白表達量最高。說明HCB在棉鈴蟲幼蟲血細胞中的表達屬于轉(zhuǎn)錄后控制機制。通過原位雜交實驗和免疫細胞化學(xué)證實了HCB在血細胞中

7、的表達，HCB在血細胞中的轉(zhuǎn)錄和翻譯主要在漿血細胞和粒血細胞中進行。HCB在幼蟲到蛹的變態(tài)過程中表達逐漸增加，說明血細胞中表達的HCB可能與棉鈴蟲幼蟲到蛹的變態(tài)有關(guān)。造血器官的發(fā)育過程和幼蟲到蛹變態(tài)時血細胞在中腸和脂肪體的分布更加證實了這一點。 本文還對不同發(fā)育時期棉鈴蟲幼蟲血細胞的數(shù)量變化進行了研究，發(fā)現(xiàn)6齡幼蟲漿血細胞、粒血細胞、珠血細胞所占比例較高，原血細胞和類絳色細胞所占比例較低。通過血細胞體內(nèi)和體外對大腸桿菌和金黃色