棉鈴蟲中肽聚糖識別蛋白PGRP-C的基因克隆及表達模式.pdf

1、無脊椎動物缺少獲得性免疫(adaptive immunity)，但是卻具有可以對病原微生物做出快速和有效應答的先天性免疫系統(tǒng)(innate immunity)。先天免疫系統(tǒng)在啟動免疫防御時首先通過一系列高度保守的模式識別受體識別病原體表面的相關分子模式進而激活細胞內信號轉導途徑來引起免疫反應。肽聚糖識別蛋白(PGRP)是一種重要的模式識別受體，它可以識別微生物表面的肽聚糖(PGN)，在激活免疫調控途徑中行使著重要作用，研究發(fā)現，它可以參

2、與吞噬作用、黑化級聯(lián)反應和抗菌肽產生等先天免疫反應中。
　　 目前已在多種昆蟲中都發(fā)現了PGRP，研究表明盡管這些PGRPs在結構上具有一定的保守性，但是其功能和表達模式卻不盡相同，因此，要想全面深入的了解PGRP在昆蟲先天免疫中的功能，可能還需要在更多類型的昆蟲中開展PGRP研究。本實驗以棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)為研究對象，克隆鑒定出一種肽聚糖識別蛋白，將其命名為HaPGRP－C，并初步研究了該基因在

3、先天性免疫中的表達模式和功能，本實驗的研究結果可以分為以下幾方面：
　　 1、棉鈴蟲肽聚糖識別蛋白基因HaPGRP-C的克隆以及序列分析：利用Smart PCR技術獲得了棉鈴蟲一個PGRP基因的全長序列，此基因具有一個完整的開放讀碼框(ORF)，從起始密碼子12bp到終止密碼子650bp處，可以編碼212個氨基酸，其編碼的蛋白有一個PGRP結構域和一個Ami結構域，其中PGRP結構域位于N端的第31個氨基酸到第173個氨基酸；而

4、且該蛋白還含有信號肽與跨膜結構域；通過序列比對發(fā)現，棉鈴蟲的PGRP與其他鱗翅目昆蟲PGRP-C同源性最高，故將其命名為HaPGRP-C。
　　 2、HaPGRP-C的組織特異性表達分析：提取棉鈴蟲的表皮、脂肪體、中腸和血細胞四種組織的總RNA，利用RT-PCR分析HaPGRP-C不同組織中的表達情況，結果發(fā)現，HaPGRP-C在除了表皮之外的其他三種組織中都有表達，而且脂肪體中表達量最大。
　　 3、微生物免疫刺激對H

5、aPGRP-C表達的影響：用大腸桿菌(革蘭氏陰性菌，G-)和金黃色葡萄球菌(革蘭氏陽性菌，G+)免疫刺激棉鈴蟲后，利用熒光定量PCR技術檢測脂肪體和血細胞中HaPGRP-C表達量變化。結果顯示：脂肪體中的HaPGRP-C的表達量在注射兩種細菌后的2h和6h無明顯變化，但是在12h后表達量出現上調；血細胞中HaPGRP-C的表達量在注射G+后2h出現顯著上調，但是6h和12h無變化，但是在注射G-后其表達量在12h出現顯著上調。這些結果表

6、明，HaPGRP-C可能參與了棉鈴蟲先天性免疫的調控。
　　 4、注射激素對HaPGRP-C的影響：對棉鈴蟲注射保幼激素類似物(JHA)和蛻皮激素(20E)后同樣利用熒光定量PCR檢測HaPGRP-C在脂肪體和血細胞中表達量的變化。結果顯示：不管在脂肪體中還是血細胞中HaPGRP-C在注射兩種激素后其表達量都無明顯變化，其表達不受兩種激素的調控。
　　 5、HaPGRP-C的原核表達：擴增出HaPGRP-C的ORF區(qū)，將

7、其克隆到原核表達載體pET32a(+)中構建重組表達質粒，然后將其轉化大腸桿菌BL21，將轉化后的菌液進行誘導表達后，利用Ni－NTA親和柱層析的方法成功獲得重組蛋白。
　　 6、重組蛋白與細菌的凝集反應：將一定量的革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌與重組蛋白混合，在顯微鏡下觀察細菌和重組蛋白的結合現象，發(fā)現HaPGRP-C與大腸桿菌基本沒有結合現象，但是與金黃色葡萄球菌的結合現象很明顯。
　　 綜上所述，本實驗克隆得到了棉鈴蟲