利用納米探針鑒定具有抗癌活性的新型噻唑烷酮類化合物的靶點(diǎn)蛋白及其雙靶向抗癌機(jī)制的研究.pdf

1、小分子化合物可以通過對細(xì)胞內(nèi)大分子的作用來調(diào)節(jié)其功能，從而影響細(xì)胞的進(jìn)程。小分子化合物的這種作用，使其在藥物開發(fā)和生命科學(xué)研究上的應(yīng)用非常廣泛。由于許多藥物都是基于細(xì)胞表型的篩選而發(fā)現(xiàn)的，這類藥物的作用靶點(diǎn)和作用機(jī)理往往是未知的。對于藥物作用靶點(diǎn)及其作用機(jī)制的研究可以更好地了解藥物的治療效果及其副作用，也為第二代藥物的研發(fā)提供了很好的導(dǎo)向。然而，盡管技術(shù)在不斷發(fā)展，但是生物活性的小分子化合物的靶點(diǎn)鑒定仍然是藥物化學(xué)和化學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域的一個

2、關(guān)鍵問題。
　　 常用的靶點(diǎn)鑒定方法大致可以分為兩種類型:一種是直接分離鑒定可以與小分子化合物結(jié)合的蛋白;另一類方法是通過組學(xué)的方式，比如基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)，來尋找化合物作用后的基因和蛋白水平的變化，從而間接的推倒出化合物的作用靶點(diǎn)。與后者相比，直接分離鑒定靶點(diǎn)的方法的好處是可以得到直接的靶點(diǎn)蛋白信息，容易找到化合物最上游的作用靶點(diǎn)。這類方法主要是以親和純化為基本思路，需要將化合物連接上可分離的固相載體或者可直接觀測的熒光分子

3、等，主要包括親和層析法、生物素化法、同位素或熒光標(biāo)記法、光親和法等。其中，最簡單最經(jīng)典的親和層析法需要把所研究的化合物修飾后連接到固相載體上，然后與所需的細(xì)胞、器官或有機(jī)體的裂解物孵育，通過簡單的過濾、洗滌、和洗脫將親和結(jié)合而來的蛋白從細(xì)胞的全蛋白中分離出來。這種方法的好處在于操作簡便，體系復(fù)雜程度低，以及適用范圍廣。然而，由于化合物連接在固相載體上可能使其失去原有的生物活性，從而無法與靶點(diǎn)蛋白結(jié)合，所以該方法最大的缺陷在于無法檢測連接

4、在固相載體上的化合物是否仍然保持其原來的生物活性。
　　 針對這一點(diǎn)，我們建立了一種利用納米探針來鑒定化合物靶點(diǎn)蛋白的方法。將待鑒定的小分子化合物修飾連接上含有硫辛酸的結(jié)構(gòu)，使其可以通過金硫鍵連接在金納米顆粒表面。這種表面連接有小分子的金納米探針可以從細(xì)胞的全蛋白中“釣”出與小分子特異性結(jié)合的靶點(diǎn)蛋白。這種方法是基于親和層析法建立的，卻彌補(bǔ)了親和層析法的不足。由于金納米材料具有易于合成，易于表面修飾，易于被細(xì)胞攝取，金納米本身的

5、細(xì)胞毒性較小等特點(diǎn)，該方法的優(yōu)勢在于可以進(jìn)入活細(xì)胞，在鑒定靶點(diǎn)蛋白之前判斷連接在納米顆粒上的小分子是否仍保持其生物活性，從而提高靶點(diǎn)鑒定的準(zhǔn)確率。
　　 運(yùn)用這個方法，我們成功地鑒定了能選擇性殺死非小細(xì)胞肺癌H460細(xì)胞的噻唑烷酮類化合物1的作用靶點(diǎn)。在鑒定靶點(diǎn)之前，我們先檢測了連接有化合物1的金納米探針對H460細(xì)胞的殺傷作用。在確定了金納米探針基本保持了化合物1原有的生物活性之后，才開始利用該金納米探針進(jìn)行靶點(diǎn)的分離與鑒定。

6、在鑒定的過程中，我們利用了一個與化合物1結(jié)構(gòu)相似的對H460細(xì)胞抑制作用很弱的化合物3作為陰性對照，經(jīng)SDS-PAGE分離后，成功地觀察到兩條與化合物1特異性結(jié)合的蛋白的條帶。之后，通過對這兩條帶中的蛋白進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（MALDITOF/TOFMS）分析和Mascot數(shù)據(jù)庫檢索，確定了化合物1的靶點(diǎn)蛋白為微管蛋白(α-tubulin)和熱激蛋白90(HSP90)。我們利用細(xì)胞外微管聚合實(shí)驗，H460細(xì)胞的微管免疫熒

7、光檢測和微管損傷下游蛋白JNK磷酸化的檢測，驗證了化合物1對微管蛋白的靶向作用;同時，通過檢測HSP90底物蛋白CRAF-1，ERBB2和磷酸化的AKT在細(xì)胞內(nèi)的水平，也驗證了化合物1對HSP90的作用。我們的工作證明了納米技術(shù)在藥物發(fā)現(xiàn)和化學(xué)生物學(xué)研究領(lǐng)域中的重要價值。以往的靶點(diǎn)鑒定方法都必須在知道靶點(diǎn)之后再進(jìn)行靶點(diǎn)真實(shí)性的判斷，這將是一個冗長又昂貴的過程，使得作用機(jī)制的分析成為藥物發(fā)現(xiàn)的一個限速步驟。而納米探針的應(yīng)用，可以在靶點(diǎn)鑒定

8、之前對探針的生物活性保持與否做出預(yù)先的判斷，從而提高研究效率，所以納米探針在這個領(lǐng)域?qū)缪菀粋€至關(guān)重要的角色。除此之外，我們還揭示了新型噻唑烷酮類化合物的微管干擾作用及其雙靶向的特性。
　　 微管蛋白作為常用抗癌藥物的主要作用靶點(diǎn)之一，一直以來都受到廣泛的關(guān)注。從微管蛋白正常的聚合/解聚被破壞到最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡的整個過程，受到細(xì)胞內(nèi)多種信號分子的調(diào)節(jié)。其中，細(xì)胞激酶就是一類起關(guān)鍵作用的信號分子。在微管損傷之后，一些激酶可以介導(dǎo)細(xì)

9、胞存活，抑制凋亡的發(fā)生，而另一些激酶的激活卻可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡。目前，仍然有很多與微管損傷相關(guān)的激酶需要進(jìn)一步的探究，更好地理解微管損傷與激酶的關(guān)系將會大大增強(qiáng)癌癥治療的效果。
　　 鑒于本實(shí)驗室合成的新型噻唑烷酮類化合物可能作用于微管蛋白及其雙靶向的潛質(zhì)，我們從一系列噻唑烷酮類化合物中篩選出兩個在細(xì)胞外具有相似抑制微管聚合能力的化合物（探針A和探針B）。通過研究這兩個化合物在細(xì)胞中的不同效應(yīng)及對激酶不同的作用能力，來深入探討激酶

10、在微管損傷后的影響。我們發(fā)現(xiàn)，雖然探針A和B在細(xì)胞外抑制微管蛋白聚合的能力相當(dāng)，但是二者在細(xì)胞水平上對微管的影響，細(xì)胞周期阻滯的恢復(fù)及細(xì)胞凋亡的程度都有明顯的差別。通過體外激酶實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，探針A可以顯著抑制Dyrk1B激酶的活性，而B化合物對所檢測的激酶都沒有明顯地作用。我們進(jìn)一步檢測了探針A和B在細(xì)胞內(nèi)對Dyrk1B激酶的影響，發(fā)現(xiàn)探針A和B引起微管損傷后都可以激活Dyrk1B激酶，但是探針A作用的細(xì)胞中Dyrk1B激酶的活性遠(yuǎn)低于探針

11、B作用后的活性，這不僅更加充分地證明了探針A對Dyrk1B激酶的抑制，而且表明了Dyrk1B激酶在微管損傷后活性會顯著的提高。根據(jù)已有的關(guān)于Dyrk1B激酶介導(dǎo)細(xì)胞存活功能的報道，以及我們以上的研究結(jié)果，可以認(rèn)為Dyrk1B激酶在微管損傷后被激活，從而起到保護(hù)細(xì)胞，維持細(xì)胞生存的作用。通過進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，在微管損傷后Dyrk1B激酶介導(dǎo)細(xì)胞存活主要通過以下兩個途徑:一方面，通過促進(jìn)微管相關(guān)蛋白4(MAP4)的表達(dá)量升高，從而增強(qiáng)微管的