簡介：第二軍醫(yī)大學碩士學位論文MIRNA一429對人乳腺癌BCAP37細胞生物學行為的調(diào)控及相關研究THEROLEOFMIRNA一429ONTHEBIOLOGICALBEHAVIORSOFBREASTCANCERBCAP37CELLSANDTHERELATEDRESEARCH研究生秦科宇專業(yè)名稱外科學導師姓名盛渡第二軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院上海長海醫(yī)院二O一五年五月目錄摘要1ABSTRACT4英文縮略詞表6前言7再U吞‘7課題設計10材料和方法11一、材料1L二、儀器設備一11三、實驗方法12結(jié)果18討侖26文獻綜述30參考文獻43在讀期間參加科研工作情況54致謝55

簡介：目的骨髓間充質(zhì)干細胞BONEMARROWMESENCHYMALSTEMCELLSBMSCS已經(jīng)成為組織工程中重要的的種子細胞在多種疾病的臨床治療中具有廣闊的應用前景。而若想深入研究BMSCS的存活、增殖、分化及在體內(nèi)的遷移、歸巢情況首先需要解決如何高效、安全地標記BMSCS的問題。本文通過觀察SPIO、DAPI和CMDIL對家兔BMSCS的聯(lián)合標記效果及其對細胞存活、增殖以及分化的影響為BMSCS的活體示蹤研究奠定理論及實驗基礎。方法分離培養(yǎng)家兔骨髓間充質(zhì)干細胞用SPIO、DAPI和CMDIL聯(lián)合標記后采用普魯士藍染色法檢測SPIO標記率熒光顯微鏡檢測熒光標記率透射電子顯微鏡觀察細胞的超微結(jié)構(gòu)及SPIO在細胞內(nèi)的分布臺盼藍拒染法檢測細胞活力MTT法檢測細胞增殖力并使用地塞米松、胰島素、3異丁基一1一甲基黃嘌呤、吲哚美辛體外誘導標記細胞向脂肪細胞分化并用透射電子顯微鏡鑒定誘導后細胞使用5一氮雜胞苷體外誘導標記細胞向心肌細胞分化并用免疫熒光鑒定誘導后細胞。結(jié)果SPIO、DAPI和CMDIL在體外對家兔BMSCS的聯(lián)合標記率幾乎達100％透射電鏡下可見電子密度高的SPIO顆粒主要分布于溶酶體、線粒體內(nèi)部及胞內(nèi)其他膜性結(jié)構(gòu)上細胞核內(nèi)未見分布且聯(lián)合標記BMSCS的超微結(jié)構(gòu)顯示清晰、形態(tài)保存良好臺盼藍拒染法顯示聯(lián)合標記BMSCS組的細胞活力與未標記BMSCS組相比差異無統(tǒng)計學意義P＞005MTT法檢測發(fā)現(xiàn)聯(lián)合標記BMSCS組的細胞增殖力與未標記BMSCS組相比差異無統(tǒng)計學意義P＞005聯(lián)合標記BMSCS經(jīng)地塞米松、胰島素、3異丁基一卜甲基黃嘌呤一吲哚美辛體外誘導后透射電鏡下可見胞漿內(nèi)出現(xiàn)脂滴聯(lián)合標記BMSCS經(jīng)5氮雜胞苷體外誘導后免疫熒光鑒定心肌特異性肌鈣蛋白TCTNT陽性。結(jié)論SPIO、DAPI和CMDIL對家兔骨髓間充質(zhì)干細胞的聯(lián)合標記率高并對其存活、增殖以及分化無影響。

簡介：分類號R373密級不保密UDC610學校代碼11065碩士學位論文EB病毒BARF1及其變異型基因改變鼻咽癌細胞生物學行為機制的初步研究沈智超指導教師王云教授學科專業(yè)名稱病原生物學論文答辯日期201562MECHANISMSOFEPSTEINBARRVIRUSENCODEDBARF1ITSVARIANTTOAFFECTTHEBIOLOGICALBEHAVISOFNASOPHARYNGEALCARCINOMACELLLINESABSTRACTBACKGROUNDOBJECTIVETHEEPSTEINBARRVIRUSEBVENCODEDBARF1GENEISCONSIDEREDASONEOFTHEVIRUSONCOGENEITSTRANSFMATIONROLEHASBEENDEMONSTRATEDINVARIOUSCELLLINESBARF1ISFREQUENTLYEXPRESSEDINNASOPHARYNGEALCARCINOMANPCINDICATINGTHATBARF1GENEMAYPLAYANIMPTANTROLEINNPCOURPREVIOUSSTUDYSHOWEDTHATBARF1ITSVARIANTV29AINCREASETHEANTIAPOPTOSISMIGRATIONABILITIESOFNPCCELLLINECNE1THISSTUDYAIMSTOFURTHEREXPLETHEONCOGENICFUNCTIONSOFBARF1ITSVARIANTINEBVNEGATIVENPCCELLLINESHONE1INVESTIGATETHEMECHANISMSOFBARF1TOAFFECTTHEBIOLOGICALBEHAVISOFNPCCELLLINESMETHODSTHECELLBIOLOGICALBEHAVIANALYSISWERECONDUCTEDINCLUDINGMTTASSAYCOLONYFMATIONASSAYANTIAPOPTOSISASSAYCELLMIGRATIONINVASIONASSAYINVIVOTUMIGENICITYTESTINPROTOTYPEBARF1V29AVARIANTBARF1TRANSFECTEDCELLSUNDERTHECONTROLOFLENTIVIRUSVECTTRANSFECTIONGROUPTHEDIFFERENTIALLYEXPRESSEDGENESBETWEENTHEBARF1TRANSFECTEDCELLSTHEVECTTRANSFECTEDCELLSWEREDETECTEDBYCDNAMICROARRAYTECHNIQUEFUNCTIONALONTOLOGIESPATHWAYANALYSISFTHEBARF1MODULATEDGENESWASAPPLIEDTHEBARF1RELATEDCANCERPATHWAYSKEYGENESWEREVALIDATEDINNPCCELLLINESXENOGRAFTTUMSRESULTS1EXPRESSIONOFPROTOTYPEBARF1VARIANTBARF1INHONE1CELLLINESINCREASEDCELLPROLIFERATIONCOLONYFMATIONABILITYP005ENHANCEDTHECELLANTIAPOPTOSISMIGRATIONINVASIONABILITYP005NODIFFERENCEWASFOUNDBETWEENPROTOTYPEVARIANTBARF1EXPRESSINGCELLS2BARF1EXPRESSIONINHONE1CELLSDIDNOTENHANCETHEINVIVOTUMIGENICITYINNUDEMICE3THEPROTOTYPEBARF1VARIANTBARF1TRANSFECTEDCELLSDEMONSTRATEDSIMILAREXPRESSIONPROFILETHEYSHOWED317DIFFERENTIALLYEXPRESSEDGENESCOMPAREDWITHVECTTRANSFECTEDCELLSINCLUDING94UPREGULATEDGENES223DOWNREGULATEDGENESTHEBARF1MODULATEDGENESWEREINVOLVEDINCELLADHESIONCELLSIGNALTRANSDUCTIONCELLAPOPTOSISCELLPROLIFERATIONCELLMIGRATIONINVASIONPARTICIPANTEDINMANYPATHWAYSSUCHASCYTOKINECYTOKINERECEPTINTERACTIONERBBSIGNALINGPATHWAYPATHWAYSINCANCER

簡介：目的通過研究肺動脈高壓PULMONARYARTERIALHYPERTENSION，PAH大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞BONEMARROWMESENCHYMALSTEMCELLS，BMSCS的增殖、血管形成能力并其探討生物學特性。為BMSCS移植治療PAH提供初步的實驗依據(jù)。方法在大鼠腹腔內(nèi)給予10％野百合堿60MGKG注射建立肺動脈高壓模型，按體重注射相應體積生理鹽水制作正常組模型MCT注射3周后同時測定PAH組和正常組大鼠肺血流動力學參數(shù)（平均肺動脈壓）、測左心室LV、室間隔S及右心室RV質(zhì)量，利用RVLVS計算得到右心室肥厚指數(shù)RVHIHE染色觀察肺小動脈壁結(jié)構(gòu)通過血球自動分析儀測定大鼠靜脈血中的中性粒細胞百分比密度梯度離心聯(lián)合貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)PAH組和正常組大鼠BMSCS，倒置顯微鏡下觀察并用照相機拍照BMSCS形態(tài)用流式細胞儀儀器檢測細胞多個表面抗原來綜合鑒定BMSCS，并在體外進行血管形成實驗CCK8法測定BMSCS的生長曲線。結(jié)果1野百合堿注射3周后，較正常組大鼠，PAH組大鼠MPAP和RVHI明顯升高P＜001。2靜脈血分析與正常組大鼠相比，PAH組大鼠中性粒細胞百分比顯著升高P＜001。3HE染色切片顯示PAH組大鼠肺小動脈管壁較正常組大鼠顯著增厚。4流式細胞儀儀器檢測大鼠BMSCS表面標志較正常組大鼠，PAH組大鼠BMSCS陽性表面標志CD44、CD90表達率顯著減少P＜005，陰性表面標志CD31、CD34、CD45表達率顯著增加（P＜005）。5PAH組大鼠BMSCS較正常組大鼠生長增殖能力均明顯下降。6血管形成實驗與正常組大鼠BMSCS比較，PAH組大鼠BMSCS形成血管腔數(shù)顯著減少（P＜001）。結(jié)論1、通過采用在腹腔內(nèi)注射野百合堿的方法成功制作大鼠肺動脈高壓模型。2、PAH大鼠體內(nèi)存在炎癥。3、采用FICOLL密度梯度離心法聯(lián)合貼壁篩選法得到骨髓間充質(zhì)干細胞，但PAH組大鼠BMSCS純度低。4、PAH組大鼠BMSCS的生長、增殖及血管形成能力減低。

簡介：蘇州大學學位論文獨創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明所提交的學位論文是本人在導師的指導下，獨立進行研究工作所取得的成果。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不含其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不含為獲得蘇州大學或其它教育機構(gòu)的學位證書而使用過的材料。對本文的研究作出重要貢獻的個人和集體，均已在文中以明確方式標明。本人承擔本聲明的法律責任。論文作者簽名么弘型出7蘇州大學學位論文使用授權(quán)聲明咖0燦0㈣岫㈣㈣㈣IIIY2121766本人完全了解蘇州大學關于收集、保存和使用學位論文的規(guī)定，即學位論文著作權(quán)歸屬蘇州大學。本學位論文電子文檔的內(nèi)容和紙質(zhì)論文的內(nèi)容相一致。蘇州大學有權(quán)向國家圖書館、中國社科院文獻信息情報中心、中國科學技術(shù)信息研究所含萬方數(shù)據(jù)電子出版社、中國學術(shù)期刊光盤版電子雜志社送交本學位論文的復印件和電子文檔，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或其他復制手段保存和匯編學位論文，可以將學位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關數(shù)據(jù)庫進行檢索。涉密論文口本學位論文屬在年一月解密后適用本規(guī)定。非涉密論文口論文作者簽名盤壘日期絲忽』12導師簽名生翌查查日期趁Z至』Z

簡介：復旦大學碩士學位論文NM23H1基因轉(zhuǎn)染對人肝癌7721細胞生物學行為的影響及其機制的初步研究姓名徐伯贏申請學位級別碩士專業(yè)生物化學與分子生物學指導教師申宗侯20030524第二部分NM23H1對全反式維甲酸誘導的SMMC7721細胞凋亡及其相應信號轉(zhuǎn)導途徑的影響為了探討NM23一H1與凋亡的關系，本文研究了NM23一H1轉(zhuǎn)染對全反式維甲酸ATRA誘導的7721細胞的凋亡的影響。用流式細胞儀和熒光染色顯示，在ATRA誘導下，NM23～HL／7721細胞的凋亡數(shù)明顯增加，表明NM23一HL能促進轉(zhuǎn)染細胞的凋亡。迸一步的研究發(fā)現(xiàn)，在ATRA誘導下，NM23H1／7721細胞BCL2的表達沒有發(fā)生明顯改變，PKB的蛋白表達也沒有發(fā)生顯著變化，但其T308、473位點磷酸化均較MOCK細胞顯著降低，對抑癌基因P53的檢測表明，P53的MINA水平明顯下降。結(jié)果表明NM23一HL轉(zhuǎn)染對ATRA誘導的7721細胞的凋亡的影響不是通過下調(diào)BCL2的表達實現(xiàn)的，有可能是通過上調(diào)P53的表達，以及降低PKB的T308、473位點磷酸化從而降低PKB的活性，以此增加7721細胞對ATRA誘導的凋亡的敏感性。另外，轉(zhuǎn)染NM23HLEDNA后，P53MRNA表達明顯增強，提示RIM23一HT可能通過P53途徑誘導細胞凋亡。關鍵詞NM23一H，，凋亡，全反式維甲酸，PKB，P53，BCL一2第三部分NM23一H1轉(zhuǎn)染后SMMC7721細胞黏附、遷移能力的變化及其信號轉(zhuǎn)導途徑的探討為了研究NM23一HL轉(zhuǎn)染對SMMC7721細胞轉(zhuǎn)移潛力的影響，本文測定了轉(zhuǎn)染NM23H1后細胞黏附、遷移能力的變化，發(fā)現(xiàn)NM23H1轉(zhuǎn)染細胞的黏附和遷移能力均顯著降低。為了進一步探討其黏附和遷移能力變化的機制，本文測定了轉(zhuǎn)染細胞整聯(lián)蛋白亞基值5和BL的表達。NM23一HI／7721與MOCK細胞相比，5亞基的蛋白表達沒有發(fā)生明顯改變；而01亞基的蛋白總量也沒有發(fā)生明顯變化，但NM23一HI／7721細胞中未成熟的B1亞基即未糖基化的遠遠高于MOCK細胞。利用流式細胞術(shù)檢測細胞表面的整聯(lián)蛋白亞基A5和PL的表達，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染NM23一H1CDNA后，細胞表面A5亞基的表達也沒有改變；而B1亞基的表達明顯降低，說明PCDNA3／NM23HL轉(zhuǎn)染后可能影響了H7721細胞PL亞基的糖基化，從而影響其在細胞表面的投送。對整聯(lián)蛋白介導的酪氨酸磷酸化的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)N處

簡介：一、研究背景20世紀80年代以來，肝移植技術(shù)作為治療終末期肝病的有效手段迅速發(fā)展。近年來，越來越多的學者贊成肝臟移植術(shù)是治療無肝外轉(zhuǎn)移的肝臟惡性腫瘤患者的一個有效治療方法。肝癌作為肝移植的一個適應證，居有重要地位。SSCHT于80年代初統(tǒng)計世界上最大的4肝移植個中心，共540例，肝惡性腫瘤占139例，居第二位，僅次于肝硬化。截至2005年1月，我國累計施行肝移植手術(shù)已超過5000例，其中肝癌肝移植約占40％左右。隨著肝移植數(shù)量的增加及經(jīng)驗的積累，肝癌肝移植的問題也逐漸成為研究的熱點。近年肝癌肝移植取得了較好的臨床效果，其治療肝臟惡性腫瘤的療效等同于或優(yōu)于肝切除術(shù)。CHERQUI等研究顯示即使癌灶＞5CM的患者，移植術(shù)后1、3年無癌生存率與小肝癌組移植術(shù)后生存率相近。BISMUTH于1993年報告60例肝硬化肝癌，分肝切除與肝移植組，3年存活率雖相似50％～47％，但總的無轉(zhuǎn)移存活率移植組為46％，切除術(shù)僅27％P＜005，而在早期小肝癌癌塊1～2個，直徑≤3CM則無轉(zhuǎn)移存活率移植組為83％，切除組僅18％，P＜0001，差異極為顯著。肝癌肝移植術(shù)后免疫抑制方案是目前全球移植界關注的問題。90年代以來，國內(nèi)外在肝臟移植免疫抑制劑的應用已形成以CSA或FK506為主，聯(lián)合硫唑嘌呤和強的松的三聯(lián)用藥規(guī)范。FK506、CSA作為器官移植術(shù)后基本的免疫抑制劑，其對肝癌生長、復發(fā)、轉(zhuǎn)移的影響，一直困擾著臨床肝移植界醫(yī)生。FK506、CSA為鈣神經(jīng)素抑制劑，免疫抑制作用的靶細胞主要是T細胞，它們分別與T淋巴細胞內(nèi)的相應受體FKBPFK506BINDINGPROTEIN、環(huán)孢素親和素CYCLOPHILIN，CYP結(jié)合形成的復合體，與胞漿內(nèi)的神經(jīng)鈣蛋白結(jié)合，抑制其活性，從而阻止NFATC的核內(nèi)轉(zhuǎn)移過程，進一步抑制IL2基因的轉(zhuǎn)錄活性，抑制T細胞的活動過程，是其發(fā)揮免疫抑制效應的根本原因。FK506、CSA對肝癌影響多為臨床觀察，對體外肝癌細胞的影響及其機制探討的研究較少。我們以HEPG2肝癌細胞為研究對象，通過不同濃度的FK506、CSA作用不同時間，研究對肝癌細胞生長、細胞凋亡、增殖、細胞周期變化及細胞轉(zhuǎn)移能力，應用基因芯片技術(shù)和熒光PCR方法，從基因水平探討影向的機制。二、本課題的研究方案1MTT比色法觀察二者對HEPG2肝癌細胞生長的影響。2應用流式細胞技術(shù)研究二者對HEPG2肝癌細胞增殖、凋亡、細胞周期變化的影響。3應用細胞浸潤實驗觀察肝癌細胞浸潤能力變化。4應用基因芯片技術(shù)篩選FK506、CSA影響的基因，從基因水平探討影響的機制。5熒光PCR方法進一步探討影響細胞轉(zhuǎn)移的基因在不同濃度下對細胞轉(zhuǎn)移能力影響。第一部分他克莫司與環(huán)孢素A對HEPG2肝癌細胞生長的影響目的觀察不同濃度的他克莫司與環(huán)孢素A對肝癌的增殖、凋亡、細胞周期的影響。方法1噻唑藍MTT比色法細胞生長實驗FK506濃度分別為1、5、10、50、100、500ΜGL，CSA濃度設為5、10、50、100、500、1000ΜGL。同時設無藥對照組。分別于加藥第24、48、72H取出培養(yǎng)板，每孔加入MTT5GL20ΜL，37℃繼續(xù)孵育4H后棄培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜DMSO150ΜL，微量振蕩器振蕩5MIN，用全自動酶標儀檢測波長570NM時的吸光度值。32流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡、PCNA、細胞周期。結(jié)果1FK506作用48H、72H肝癌細胞增殖能力受到明顯抑制，當濃度大于100ΜGL，F(xiàn)K506對肝癌細胞抑制作用不明顯。2CSA處理48H、72H后肝癌細胞增殖能力明顯受到抑制。3FK506在150ΜGL及CSA在10500ΜGL，作用4872H，凋亡率明顯增加，隨濃度增加，凋亡率增加，呈濃度依賴依賴關系，超過一定該濃度時，則出現(xiàn)凋亡率減低。4FK506在150ΜGL對HEPG2細胞作用48H，細胞周期S期縮短和G1G0期延長，對細胞周期影響主要為阻滯于G1G0期。CSA對細胞周期無影響。5FK506在150ΜGL及CSA在10500ΜGLPCNA表達顯著減低。第二部分基因芯片研究他克莫司與環(huán)孢素A對HEPG2肝癌細胞基因的影響目的應用基因芯片技術(shù)研究他克莫司與環(huán)孢素A對HEPG2肝癌細胞基因的影響。方法1實驗分組實驗組1CSA為300ΜGL，實驗組2K506設為20ΜGL，未加藥物者為對照組。HEPG2細胞分別經(jīng)過處理48H后檢測取細胞標本行基因芯片。2基因芯片在深圳微芯公司實驗中心檢測。具體方法如下總RNA提取、探針標記、芯片雜交、芯片掃描、圖像結(jié)果分析、數(shù)據(jù)處理、報表生成。結(jié)果1在CSA組中具有比較明顯的功能類別特征的基因變化是蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)相關基因的表達下調(diào)，提示蛋白質(zhì)合成受到抑制；2在FK506組中比較突出的表達變化基因類型為與細胞增殖與凋亡相關的基因，提示實驗組樣品細胞存在細胞增殖的抑制以及細胞凋亡的增加。第三部分他克莫司與環(huán)孢素A對HEPG2肝癌細胞的浸潤能力影響目的探討他克莫司與環(huán)孢素A對HEPG2肝癌細胞的浸潤能力影響。方法1以HEPG2肝癌細胞為研究對象，F(xiàn)K506濃度分別為1、5、10、20、50、100ΜGL，CSA濃度為5、10、50、100、300、500ΜGL，每一濃度各設3個復孔，同時設無藥對照組3孔，經(jīng)48H處理后行熒光光定量PCR的檢測。2細胞浸潤實驗FK506和CSA處理48H的細胞加入無血清DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)1824H；PBS洗滌細胞2次，025％胰酶消化后，收集懸浮細胞，使細胞數(shù)達到02510106ML；取100UL細胞懸液加到浸潤膜上，37℃孵育30分鐘；每孔加入175配好的CYQUANTGR染色劑50UL，室溫孵育15分鐘，96孔板及浸潤膜取去，行共聚焦顯微鏡檢測，測定平均熒光強度。3熒光光定量PCR的檢測設計引物和探針、細胞RNA的提取、逆轉(zhuǎn)錄反應、熒光定量PCR反應。結(jié)果1細胞浸潤實驗顯示FK506在120ΜGL及CSA在5300ΜGL作用48H，肝癌細胞熒光強度與對照組無明顯變化，超過上述濃度范圍肝癌細胞熒光強度較對照組明顯增強。2熒光PCR檢測FK506在120ΜGL，ICAM、MMP基因拷貝數(shù)與對照組無明顯差別，F(xiàn)K506濃度超過50ΜGL表現(xiàn)為基因拷貝數(shù)明顯增加，CSA與FK506表現(xiàn)為類似的反應。全文結(jié)論1FK506、CSA對HEPG2肝癌細胞有生長抑制作用，使細胞增殖能力降低，在一定濃度和作用的時間下表現(xiàn)為促細胞凋亡作用。2FK506使細胞周期阻滯于G0G1期，CSA對細胞周期無影響。3在CSA組中具有比較明顯的功能類別特征的表達變化基因主要包括與蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)相關基因的表達下調(diào)；在FK506組中比較突出的表達變化基因類型為與細胞增殖與凋亡相關的基因，提示實驗組樣品細胞存在細胞增殖的抑制以及細胞凋亡的增加。4與對照組比較，細胞浸潤能力在低濃度下無影響，高濃度下有促腫瘤轉(zhuǎn)移作用。

簡介：點擊查看更多1、狗骨髓間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)的生物學特性、凍存技術(shù)及示蹤方法的實驗研究2、右歸飲聯(lián)合干細胞介入治療早期股骨頭缺血性壞死的實驗研究.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：胰腺癌是消化系統(tǒng)中預后最差的腫瘤之一，即使接受根治性切除術(shù)后的患者其5年生存率也只有5～10。因而深入闡明胰腺癌發(fā)生機制，尋找胰腺癌治療的新靶點對于改善預后具有重要意義。最新研究認為腫瘤是一種干細胞疾病，是由少數(shù)具有成瘤能力的腫瘤干細胞增殖發(fā)育而成的異常組織。近年來國內(nèi)外學者通過特異性的細胞表面標志已在急性髓細胞樣白血病、乳腺癌、腦腫瘤、前列腺癌、肺癌和結(jié)腸癌等腫瘤中成功分離出相應的腫瘤干細胞，并證明它們在腫瘤的形成和生長過程中的決定性作用。亦有學者從事胰腺癌干細胞的分離鑒定，但迄今尚未確定出公認的表面標志物。LI等通過鑒定提出CD44CD24ESA的細胞亞群是胰腺癌干細胞，HERMANN等認為胰腺癌干細胞的表型是CD133。另外，他們的研究主要是證明胰腺癌是由腫瘤干細胞形成的，調(diào)控其生長增殖的信號通路尚未報道。腫瘤SP細胞的分離鑒別是被一致公認的研究腫瘤干細胞生物學特性的替代方法。本研究采用流式分析證實了胰腺癌中SP細胞的存在，通過體內(nèi)體外實驗研究其包括干細胞特性在內(nèi)的生物學特性，并初步探討了PI3KMT信號通路對其生存增殖的調(diào)控作用。第一部分胰腺癌SP細胞的分離和表型分析目的分離胰腺癌中的SP細胞亞群并確定其表型。方法應用HOECHST33342染色，流式細胞儀檢測6個胰腺癌細胞系及3個原代培養(yǎng)的臨床胰腺癌標本中SP細胞的含量。選取典型的具SP細胞的細胞系檢測SP細胞的表型。結(jié)果除了BXPC3，其他胰腺癌細胞系及原代培養(yǎng)標本都存在VERAPAMIL敏感的SP細胞。PANC1、CAPAN1、ASPC1、PC3和SW1990中SP細胞的比例分別為78422，1688，043和225。3個臨床標本中SP細胞的比例分別為033279和098。PANC1、CAPAN1和ASPC1中的絕大多數(shù)SP細胞的表型為CD133和CD44CD24ESA結(jié)論胰腺癌中的確存在SP細胞，其表型為CD133和CD44CD24ESA。第二部分胰腺癌干細胞樣SP細胞生物學特性及化療耐藥機制初探目的分離鑒定胰腺癌干細胞樣的SP細胞亞群并探討其生物學特性及化療耐藥機制。方法應用HOECHST33342染色，F(xiàn)ACS分選胰腺癌細胞系PANC1中的SP細胞。通過平板克隆形成試驗和NODSCID小鼠異種移植成瘤試驗比較SP細胞與NONSP細胞的克隆形成能力及成瘤能力，通過對體外培養(yǎng)的SP細胞和SP細胞衍生腫瘤的HOECHST33342復染SP再分析判斷其是否具有分化潛能。通過成球?qū)嶒炘u價SP細胞的自我更新能力。采用TRANSWELL試驗和MTT試驗比較分選的SP細胞與NONSP細胞的侵襲能力及其對化療藥物的耐藥性。應用實時定量PCR檢測SP細胞與NONSP細胞中ABCB1和ABCG2的表達。采用流式細胞術(shù)比較SP細胞與NONSP細胞的細胞周期。結(jié)果PANC1SP細胞具有較高的自我更新能力和成瘤能力并且能夠發(fā)生不對稱分裂生成NONSP細胞。SP細胞的侵襲力及其對化療藥物的耐藥性明顯高于NONSP細胞。SP細胞中ABCB1和ABCG2的表達水平明顯高于NONSP細胞且大多數(shù)細胞處于G1期。結(jié)論胰腺癌SP細胞富集了具有高侵襲能力的干細胞樣腫瘤起始細胞，其耐藥機制可能與其大多數(shù)細胞處于靜息期及某些ABC轉(zhuǎn)運體的高表達相關。第三部分PI3KMT信號通路參與胰腺腫瘤干細胞樣SP細胞生存增殖的調(diào)控目的分離鑒定胰腺癌中腫瘤干細胞樣的SP細胞亞群并探討PI3KMT信號通路對其生存與增殖的調(diào)控。方法應用流式分析檢測胰腺癌細胞系PANC1中SP細胞的含量。觀察加入PI3KMT信號通路特異性抑制劑LY294002或雷帕霉素培養(yǎng)后PANC1中SP細胞的含量變化。采用MTT試驗和克隆形成試驗檢測LY294002或雷帕霉素對分選的SP細胞和NONSP細胞的抑制作用。結(jié)果加入LY294002或雷帕霉素培養(yǎng)后PANC1SP細胞的含量明顯降低（LY294002，760±027VS190±022，P0000；雷帕霉素，760±027VS114±020，P0000）。LY294002對SP細胞和NONSP細胞的生存抑制率（1細胞存活率）分別是4787±382和2764±209，差異有統(tǒng)計學意義（P0001）。雷帕霉素對SP細胞的生存抑制率亦高于NONSP細胞（5704±278VS3599±311，P0001）。LY294002和雷帕霉素對SP細胞的克隆形成能力的抑制率也高于NONSP細胞（LY294002，54±656VS3467±306，P001；雷帕霉素，48±361VS3067±321，P0003。結(jié)論PI3KMT信號通路參與對其生長增殖的調(diào)控，可能成為根治胰腺癌的治療新靶點。

簡介：研究背景ΝΚΤ（NATURALKILLERT細胞是一群細胞表面既有T細胞受體TCR，又有NK細胞受體的特殊T細胞亞群。該群細胞具有抗感染，抗腫瘤，免疫調(diào)節(jié)等多重功能。雖然共表達T細胞受體和NK細胞受體可以作為NKT細胞的表型指標，但是NKT細胞是一個復雜的異質(zhì)性群體，其確切的定義仍未取得一致意見。已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)CD3CD56NKT細胞是細胞因子誘導的殺傷細胞CYTOKINEINDUCEDKILLER，CIK中的主要效應細胞，其含量的多少與CIK的細胞毒活性的高低有關。目前CIK過繼免疫治療腫瘤的方法在臨床已得到應用，但是針對結(jié)核病的細胞過繼免疫療法還很少研究。由于結(jié)核病的致病菌結(jié)核桿菌是一種胞內(nèi)寄生菌，機體對它的消滅也依賴細胞免疫，所以有關結(jié)核病的細胞過繼免疫療法的研究有望成為攻克結(jié)核病的一個全新的領域。目的從活化規(guī)律、細胞數(shù)量、表型和分泌細胞因子四方面比較正常人與肺結(jié)核病人新鮮外周血中CD3CD56NKT細胞的差異；分別觀察正常人與肺結(jié)核病人PBMCPERIPHERALBLOODMONONUCLEARCELLS用RHIL2刺激后CD3CD56NKT細胞的增殖規(guī)律，再從細胞數(shù)量、表型和分泌細胞因子三方面比較正常人與肺結(jié)核病人RHIL2擴增后的CD3CD56NKT細胞的差異，以期為探討肺結(jié)核病的發(fā)病機制和治療方法開辟一個新的道路。方法1淋巴細胞各亞群的檢測方法正常人與肺結(jié)核病人外周靜脈血收集于肝素鈉抗凝的真空采血管內(nèi)，于4小時內(nèi)完成流式抗體染色處理過程，利用流式細胞儀獲取數(shù)據(jù)并分析結(jié)果，最終得出淋巴細胞各亞群的數(shù)值。2活化指標CD69的檢測方法密度梯度離心法獲取外周血單個核細胞PBMC，用RHIL2刺激PBMC，分別于刺激后0、8、16、40和64小時檢測NK細胞和NKT細胞表面CD69的表達情況。3RHIL2擴增NKT細胞的方法密度梯度離心法獲取外周血單個核細胞PBMC，加入RHIL2刺激培養(yǎng)人外周血單個核細胞PBMC，以后每23天補充RHIL2和新鮮RPMI1640完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細胞兩周，分別于培養(yǎng)第0、6、10和14天檢測NKT細胞比例并計數(shù)。4NKT細胞的表型和胞內(nèi)細胞因子檢測于培養(yǎng)第0天和第14天收集細胞，流式細胞儀檢測NKT細胞的表面分子ΓΔTCR、CD4、CD8和CD161的表達情況以及胞內(nèi)細胞因子IFNΓ、IL4、TNFΑ和IL17的分泌量。結(jié)果1肺結(jié)核病人N42與正常人N30相比，NKT細胞和TH細胞比例未發(fā)生顯著變化，NK細胞比例顯著增加P2PBMC經(jīng)RHIL2刺激0H、8H、16H、40H和64H后，正常人NK細胞和NKT細胞表面CD69表達量均顯著增加（與0H比較，P005），其余各時間點表達量均高于正常組（P005），其余各時間點表達量均高于正常組（P3正常人PBMC在RHIL2刺激培養(yǎng)14天后，細胞總數(shù)由（086±018）106擴增到（3828±456）106（P4正常人外周血中NKT細胞高表達CD8，擴增后的NKT細胞則高表達ΓΔTCR、CD161；結(jié)核病人外周血中NKT細胞CD8表達量低于正常人，擴增后NKT細胞ΓΔTCR降低，CD8、CD4、CD161的表達量則增高，ΓΔTCR、CD4的表達量低于正常人，CD8、CD161的表達量則高于正常人。5正常人外周血中NKT細胞能夠分泌IFNΓ、TNFΑ、IL4和IL17，擴增后NKT細胞分泌IFNΓ、TNFΑ的量顯著增加；肺結(jié)核病人外周血中NKT細胞也能夠分泌IFNΓ、TNFΑ、IL4和IL17，但擴增前后這些細胞因子的量無差異；正常人擴增后的NKT細胞分泌IFNΓ、TNFΑ的量顯著高于肺結(jié)核病人。結(jié)論1肺結(jié)核病人的T細胞、ΓΔT細胞、TC細胞和B細胞低于正常人，NK細胞、THTC比值高于正常人，而NKT細胞、TH細胞則與正常人相似。2肺結(jié)核病人NK細胞，NKT細胞的活化均高于正常人。3肺結(jié)核病人的NKT細胞增殖應答低于正常人。4肺結(jié)核病人NKT擴增后的ΓΔT細胞比例比正常人低。5肺結(jié)核病人的IFNΓ、TNFΑ產(chǎn)生低于正常人。

簡介：授一予單位代碼學號或申請?zhí)柮芗?14592川64091公開文學論大位州學鄭士碩專業(yè)學位NOFCHL過表達對宮頸癌HELA細胞生物學特性的影響院系名稱別名位類者姓學作導師姓名、職稱基礎醫(yī)學院醫(yī)學碩士王丹郡文海教授呂玉民研究員2009年05月鄭州大學2009屆碩士學位論文中文摘要當NOTCHL信號被阻斷后，在T細胞急性淋巴白血病TALL中發(fā)生細胞靜止，表明對NOTCHL信號的調(diào)控是一種治療腫瘤的有效的方法。另外，現(xiàn)在已經(jīng)證實，異常的NOTCHL信號在其它類型的白血病和粘液表皮樣瘤中起著十分重要的作用。NOTCHL作為致癌基因或抑癌基因取決于不同類型的細胞。對NOT。HL信號途徑了解的增多將有助于利用NOTCHL作為分子靶點治療癌癥。然而，關于NOTCHL信號途徑與宮頸癌相互作用關系的報道尚無定論性的結(jié)果。為了更清楚理解NOTCHL信號途徑與宮頸癌發(fā)生的關系，本研究首先通過構(gòu)建真核表達載體，研究NOTCHL的過表達在宮頸癌中的作用，并通過CCK一8試劑研究過表達NOTCHL對宮頸癌HELA細胞增殖的影響，進一步通過流式細胞術(shù)研究過表達NOTCHL對宮頸癌HELA細胞周期及凋亡的影響，最后通過BOYDENCHAMBER研究其對浸潤轉(zhuǎn)移的影響，該研究旨在為以NOTCHL信號途徑為靶點宮頸癌基因治療的提供理論依據(jù)。方法1、從胎盤組織中提取總RNA，經(jīng)RL’PCR擴增人NOTCHL胞內(nèi)區(qū)全長，利用及初11和方去AL分別對PCR產(chǎn)物和PEDNA31進行雙酶切。用T4DNA連接酶分別連接上述回收的片段，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109細胞，涂板，過夜培養(yǎng)，挑克隆，提質(zhì)粒，雙酶切鑒定。2、真核表達載體PCDNANICD通過脂質(zhì)體LIP。介CTAMINE2000轉(zhuǎn)染宮頸癌HELA細胞，并利用G418篩選出穩(wěn)定表達株。3、采用半定量RL’PER和WESTEMBLOTTING分析轉(zhuǎn)染前后NOTCHL和HESLMRNA和蛋白表達的變化。4、采用CCK一8檢測試劑盒分析過表達NOTCHL對細胞增殖的影響。5、利用流式細胞術(shù)分析轉(zhuǎn)染前后細胞周期及凋亡的變化。6、BOYDENCHAMBER實驗計算各組穿膜的細胞數(shù)以比較轉(zhuǎn)染NOTCHL基因?qū)毎忠u能力的影響。7、統(tǒng)計學處理RL’PCR和WESTEMBLOTTING結(jié)果均采用GEOOLS軟件進行灰度值分析，上述試驗均分別重復三次。統(tǒng)計學處理均采用SPSS130統(tǒng)計軟件，統(tǒng)計學數(shù)據(jù)用均數(shù)士標準差X士S表示，行單因素方差分析ONE一WAYANOVA，尸DOS具顯著性。

簡介：第一部分一、目的證實肝硬化組織中存在人肝臟祖細胞HPCS，探討HPCS分布及激活的強度與肝臟炎癥程度的關系提供HPCS向肝細胞分化的依據(jù)。方法對30例肝硬化及3例正常組織標本進行常規(guī)組織學觀察，對門脈炎癥程度進行評分，并用膽管上皮標志CK7和肝星狀細胞激活標志SMA進行免疫組化染色，對符合HPCS、中間型肝細胞以及小管樣反應的細胞進行計數(shù)和半定量評分。結(jié)果在正常肝組織中無門脈周圍HPCS和小管樣反應增殖。在肝硬化組織中，增殖的HPCS起源于肝門脈區(qū)域，隨著門脈炎癥程度加重，HPCS及小管樣反應從肝硬化結(jié)節(jié)周圍向肝實質(zhì)擴散并出現(xiàn)中間型肝細胞增殖，其周圍有顯著的肝星狀細胞激活。HPCS及小管樣反應增殖程度隨著門脈炎癥程度的加重而增加。HPCS數(shù)目與中間型肝細胞數(shù)目之間存在正直線相關。ALT和AST與HPCS及中間型肝細胞數(shù)目存在正直線相關。結(jié)論在人肝硬化中存在祖細胞的激活，炎癥反應是HPCS激活的觸發(fā)因素，HPCS向肝實質(zhì)內(nèi)遷移并向肝細胞方向分化是肝再生的重要途徑。第一部分二、目的研究不同肝臟祖細胞標志物在人肝硬化組織中的定位和分布，明確肝臟祖細胞群的免疫表型特征。方法用OV6，CK7，CK19，HEPATOCYTE，CKIT以及AFP對30例肝硬化及3例正常肝組織進行免疫組化染色和激光共聚焦免疫熒光雙標，觀察這些標志物在不同細胞群中的分布。結(jié)果正常肝臟中，膽管和膽小管上皮CK7及CK19陽性，OV6及CKIT陰性。在肝硬化中，門脈周圍區(qū)域的肝臟祖細胞HPCS及小管樣反應細胞主要為OV6CK19CK7HEPATOCYTE，少數(shù)為OV6。隨著門脈及實質(zhì)內(nèi)炎癥的加重，HPCS及小管樣反應從肝硬化結(jié)節(jié)周圍向肝實質(zhì)擴散并出現(xiàn)中間型肝細胞增殖。HPCS及小管樣反應細胞主要為OV6CK19CK7HEPATOCYTE或；中間型肝細胞為OV6CK19CK7HEPATOCYTE少數(shù)HEPATOCYTE。門脈周圍區(qū)域和纖維間隔內(nèi)存在少量的CKIT細胞，個別陽性細胞整合到成熟膽管，其余CKIT細胞不共表達OV6、CK7及CK19。結(jié)論人肝硬化存在肝臟祖細胞的激活；肝臟祖細胞群的免疫表型差異表明祖細胞處于不同的分化增殖階段；不同肝臟祖細胞標志物的聯(lián)合運用是鑒別和研究肝臟祖細胞的有力工具。第一部分三、目的研究肝臟祖細胞標志物CKIT、CK7在肝細胞肝癌HCC組織中的表達及其與臨床病理的關系。方法對40例肝細胞肝癌標本及3例正常組織標本進行常規(guī)組織學觀察以及CKIT、CK7、CD45免疫組化染色，對腫瘤細胞的分化程度進行分型，分析CKIT、CK7表達與肝細胞肝癌的臨床病理特征的聯(lián)系。結(jié)果正常肝臟中CKIT染色陰性。1940例HCC組織中存在CKIT腫瘤細胞，在腫瘤細胞之間或腫瘤結(jié)節(jié)周圍分散分布。30例75％存在CK7陽性癌細胞，陽性程度強弱不一，主要存在兩種不同免疫反應形態(tài)特征。HBSAG及ANTIHBC在CKIT及CK7HCC表達更常見P結(jié)論骨髓來源的肝臟祖細胞參與了HCC的形成和發(fā)展，CKIT、CK7對于判斷HCC預后有一定意義。第二部分目的闡明在卵圓細胞介導的肝再生中肝臟非實質(zhì)細胞、胞外基質(zhì)成分與卵圓細胞的相互作用，分析肝臟微環(huán)境對卵圓細胞的調(diào)控作用。方法采用免疫組化及免疫熒光雙標的方法動態(tài)觀察在2AAFPH大鼠卵圓細胞增殖模型中，隨著卵圓細胞的增殖和分化，KUPFFER細胞、肝星狀細胞、肝臟胞外基質(zhì)成分層粘連蛋白和纖維連接蛋白的定位及與卵圓細胞的相互關系。結(jié)果PH后第2天，小卵圓細胞開始向門靜脈周圍區(qū)域增殖。DESMIN的HSCS及LAMININ主要出現(xiàn)在門靜脈周圍的肝竇狀隙內(nèi)，而KUPFFER細胞和FIBRONECTIN在整個肝小葉內(nèi)表達顯著增加。從術(shù)后第4到第9天，卵圓細胞進一步向肝實質(zhì)內(nèi)增殖，與HSCS、LAMININ及FIBRONECTIN關系密切，KUPFFER細胞與卵圓細胞混合在一起增殖，第6天以后開始減少。從術(shù)后第12到第15天，隨著卵圓細胞分化為小肝細胞節(jié)結(jié)，大多數(shù)HSCS、LAMININ及FIBRONECTIN位于節(jié)結(jié)周邊，少數(shù)出現(xiàn)在節(jié)結(jié)內(nèi)，KUPFFER細胞主要出現(xiàn)在中央靜脈周圍區(qū)域。第18天以后，正常的肝小葉結(jié)構(gòu)開始恢復。結(jié)論在肝損傷后的重建修復過程中，卵圓細胞與肝臟非實質(zhì)細胞、胞外基質(zhì)成分存在緊密的聯(lián)系，局部肝臟微環(huán)境可能通過細胞與細胞之間以及細胞與基質(zhì)之間的相互作用在卵圓細胞介導的肝再生中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。第三部分目的建立大鼠卵圓細胞增殖模型，探討其分離、鑒定、培養(yǎng)的方法；檢測卵圓細胞端粒酶活性及相關基因表達，探討與其增殖分化之間的關系。方法采用2AAFPH模型誘導大鼠卵圓細胞增殖，2AAF劑量為15MGKG，于術(shù)后912天采用改良的膠原酶灌注消化密度梯度離心法分離卵圓細胞，用電鏡、RTPCR、細胞免疫熒光鑒定卵圓細胞，采用免疫組化、RTPCR及端粒酶活性檢測試劑盒檢測分離的卵圓細胞及卵圓細胞系LE6端粒酶的表達，并分析其意義。結(jié)果采用2AAFPH模型成功誘導大鼠卵圓細胞增殖。分離的卵圓細胞核大，卵圓形，胞漿少，呈鋪路石樣生長，細胞直徑約7～12ΜM，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)有少量絨毛樣突起，核漿比例大，胞漿內(nèi)細胞器少且發(fā)育不成熟。細胞免疫熒光、RTPCR結(jié)果顯示表達0V6、AFP、CK19、ALBUMIN、CKIT、CK18、THY1。免疫組織化學顯示端粒酶催化亞單位TERT表達在門靜脈周圍增殖的卵圓細胞細胞核內(nèi)，隨著卵圓細胞逐漸向肝細胞方向分化，TERT陽性細胞數(shù)目顯著較少。分離的卵圓細胞及卵圓細胞系均表達端粒酶亞單位TERT及TR，與LE6相比，剛分離的卵圓細胞表達水平更低；隨著LE6傳代次數(shù)的增加，端粒酶活性逐漸降低。結(jié)論采用劑量為15MGKG的2AAFPH模型可誘導卵圓細胞大量增殖；改良的膠原酶灌注消化、密度梯度離心的分離方法可獲取純度較高的卵圓細胞；端粒酶活性可能是卵圓細胞維持其增殖能力和多分化潛能的一個必要條件。

簡介：研究背景血管長期暴露于搏動性血流的作用下，后者產(chǎn)生的機械生物力對于正常的血管結(jié)構(gòu)和功能的維持具有關鍵作用。血管中的搏動性血流主要產(chǎn)生兩種形式的機械生物力，分別是平行于血管長軸的剪切力SHEARSTRESS和垂直于血管長軸的機械牽張力STRETCHSTRESS。內(nèi)皮細胞襯于血管最里面，直接與血流接觸，因此剪切力主要作用于血管內(nèi)皮細胞。而牽張力主要是由于心臟周期性搏動引起的血管擴張產(chǎn)生的，因此作用于血管各層細胞，但血管平滑肌細胞VSMCS是其主要的靶細胞。大量的體內(nèi)外研究證實，機械牽張力調(diào)節(jié)血管平滑肌細胞的增殖、凋亡、遷移以及表型等生物學功能。一般認為，在正常情況下牽張力9％～12％ELONGATION抑制平滑肌細胞的增殖、凋亡等功能，對于維持血管平衡具有重要調(diào)節(jié)作用，而在高血壓、動脈粥樣硬化等病理情況下，異常增高的牽張力＞15％ELONGATION則促進平滑肌細胞的增殖、遷移、凋亡等功能，誘導正常的血管結(jié)構(gòu)改變和功能失調(diào)。近年來國內(nèi)外學者對機械牽張力調(diào)控平滑肌細胞生物學功能的分子機制做了深入研究，認為細胞表面具有力學信號感受作用的各種分子可以將胞外的機械信號轉(zhuǎn)化為胞內(nèi)的化學信號，通過激活一系列的信號通路和轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)各種基因的表達，從而誘導細胞生物學功能改變。但是目前對這一機械信號轉(zhuǎn)導過程中的諸多機制尚不清楚，比如細胞表面是否存在特異性的力學信號感受分子，細胞內(nèi)各信號分子之間的相互作用模式，以及在轉(zhuǎn)錄水平之外的基因表達調(diào)節(jié)機制等。進一步深入了解牽張力調(diào)節(jié)細胞功能的分子機制，對于尋找新的高血壓、冠心病等心血管疾病干預靶點具有重要的意義。MICRNASMIRNAS是一類內(nèi)源性的非編碼小RNA分子，通過抑制靶基因的翻譯或促進MRNA的降解在轉(zhuǎn)錄后水平負調(diào)控基因表達。研究證實，MIRNAS在心血管系統(tǒng)的正常發(fā)育以及多種病理過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)，MIRNAS也參與機械生物力調(diào)節(jié)血管細胞的生物學效應，與靜止培養(yǎng)相比，剪切力誘導多個內(nèi)皮細胞MIRNAS表達改變，其中MIR19A與MIR23B在剪切力調(diào)控細胞周期中發(fā)揮關鍵作用，MIR92A介導剪切力對內(nèi)皮細胞NO的水平的調(diào)控。但是關于牽張力對血管細胞MIRNAS表達的影響，以及后者在牽張力介導的細胞生物學功能中的作用目前還不清楚。MIR21是近年廣泛研究的一種MIRNA，其在多種實體腫瘤細胞中表達升高，具有顯著的促進細胞增殖、抑制細胞凋亡作用。此外，MIR21在血管細胞中也有豐富表達，并且在損傷血管中表達上調(diào)，促進新生內(nèi)膜的形成。新近的研究發(fā)現(xiàn)，MIR21在內(nèi)皮細胞中的表達受到剪切力的調(diào)節(jié)，并且不同形式的剪切力對MIR21表達的影響是不同的，MIR21分別在剪切力介導的內(nèi)皮炎癥、NO生成中發(fā)揮重要調(diào)控作用。MIR21在血管平滑肌細胞中的表達豐度明顯高于內(nèi)皮細胞中，鑒于MIR21在細胞增殖、凋亡調(diào)節(jié)中的作用以及機械牽張力對平滑肌細胞生物學功能的影響，我們推測牽張力可能通過調(diào)節(jié)MIR21在血管平滑肌細胞中的水平影響細胞功能。目前對MIRNAS的研究多集中在其生物學效應方面，而對MIRNAS本身的表達調(diào)控機制知之甚少，MIR21基因位于蛋白編碼基因之間，具有獨立的啟動子區(qū)域，研究發(fā)現(xiàn)AP1，NFΚB等轉(zhuǎn)錄因子可能參與MIR21表達調(diào)控，但是在牽張力的作用下，參與調(diào)節(jié)MIR21表達的轉(zhuǎn)錄因子尚不明確。深入了解MIRNAS的表達調(diào)控機制有利于系統(tǒng)的認識牽張力調(diào)節(jié)血管平滑肌細胞功能的分子機制，因此，在本研究中我們也初步探討牽張力調(diào)節(jié)MIR21表達的上游分子機制。研究目的1在體外細胞水平，明確牽張力對血管平滑肌細胞MIR21表達的影響。2明確MIR21在牽張力介導的血管平滑肌細胞增殖與凋亡中的作用。3明確牽張力調(diào)節(jié)血管平滑肌細胞MIR21表達的分子機制。研究方法1人主動脈平滑肌細胞HASMCS培養(yǎng)HASMCS細胞株購自美國SCIENCELL公司，細胞生長至完全融合后，吸去培養(yǎng)基，用PBS沖洗細胞一遍以去除殘留的血清，然后加入適量預熱的025％胰蛋白酶，在顯微鏡下觀察到細胞細胞變圓后，吸去胰酶，加入新的平滑肌細胞完全培養(yǎng)基吹打均勻，轉(zhuǎn)入新的細胞培養(yǎng)瓶放入含5％CO2的37℃細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。2機械牽張力干預體外培養(yǎng)的HASMCS接種HASMCS至鋪有Ⅰ型鼠尾膠原的FLEXCELL6孔板中105細胞孔，待細胞生長至80％～90％融合時，利用無血清培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)24小時后，更換新的完全培養(yǎng)基或無血清培養(yǎng)基，使用FLEXCELL5000細胞牽張力儀給予HASMCS不同強度的牽張力刺激，分組如下110％牽張力組分別給予最大牽拉強度為10％，頻率為1HZ的周期性牽張力分別刺激細胞0、3、6、12、24小時。216％牽張力組分別給予最大牽拉強度為16％，頻率為1HZ的周期性牽張力分別刺激細胞0、3、6、12、24小時。3實時熒光定量PCR檢測MIR21表達水平使用INVITROGEN公司的TRIZOL提取包含MIRNAS的HASMCS總RNA，利用丹麥EXIQON公司的MIRNDNA合成試劑盒和MIRNASSYRBGREENMASTERMIX試劑盒分別進行逆轉(zhuǎn)錄和實時熒光定量PCR反應，小RNAU6作為各樣本MIR21表達水平的內(nèi)參照，每組樣本重復檢測4次。U6及MIR21PCR引物均購自EXIQON公司。4細胞轉(zhuǎn)染利用INVITROGEN公司的LIPOFECTAMINE2000分別轉(zhuǎn)染不同濃度的MIR21INHIBIT和MIMICS，調(diào)節(jié)HASMCSMIR21的表達水平，化學修飾的MIR21INHIBIT和MIMICS均由上海吉瑪公司合成，轉(zhuǎn)染PDCD4表達質(zhì)粒上調(diào)HASMCSPDCD4蛋白水平。轉(zhuǎn)染細胞48小時后，給予細胞牽張力刺激，觀察相應的細胞功能或目的蛋白水平變化。5HASMCS增殖檢測牽張力干預體外培養(yǎng)的HASMCS12小時，利用美國羅氏公司的BRDU細胞增殖檢測試劑盒或細胞計數(shù)儀檢測牽張力對HASMCS增殖的影響轉(zhuǎn)染MIR21INHIBIT或MIMICS48小時后，再給予牽張力干預12小時后，BRDU摻入法和細胞計數(shù)法檢測HASMCS增殖水平，明確MIR21在牽張力介導的HASMCS增殖中的作用。6WESTERNBLOT牽張力刺激HASMCS結(jié)束后，提取胞漿蛋白，測定蛋白濃度后加蛋白上樣緩沖液煮沸5分鐘。取15～20UG蛋白進行SDSPAGE電泳，利用WESTERNBLOT分別檢測P27，PRB，以及PDCD4蛋白表達。每個樣本重復檢測4次，ΒACTIN作為內(nèi)參。7細胞凋亡檢測利用BIPEC公司的ANNEXINVFITCAPOPTOSISDETECTIONKIT檢測HASMCS凋亡情況。牽張力干預結(jié)束后，用胰酶消化的方法收集細胞，每個樣本用400ULBINDINGBUFFER重懸，經(jīng)過15分鐘的ANNEXINVFITC標記，5分鐘PI標記后，在1小時內(nèi)進行細胞流式分析，每個樣本在流式分析中計數(shù)10000個細胞。8實時熒光定量PCR測定PRIMIR21、PREMIR21、PDCD4MRNA水平牽張力刺激HASMCS結(jié)束后，利用TRIZOL提取細胞總RNA。使用日本TAKARA公司的CDNA合成試劑盒將樣本總RNA逆轉(zhuǎn)錄為CDNA，然后利用TAKARA公司的SYBRGREEN實時定量PCR試劑盒進行PCR反應。PCR引物由上海吉瑪公司合成。PCR反應結(jié)束后得到CT值，并計算2△△CT，ΒACTIN作為PRIMIR21、PREMIR21、PDCD4MRNA表達水平的內(nèi)參。9細胞免疫熒光16％牽張力刺激體外培養(yǎng)的HASMCS3小時后，利用免疫熒光方法觀察CFOS、CJUN的表達變化。牽張力刺激細胞結(jié)束后，免疫染色固定液固定30分鐘，PBS沖洗后加01％TRITONX100室溫下孵育8分鐘，繼之用5％BSA封閉30分鐘，經(jīng)PBS沖洗后4℃條件下分別孵育CFOS，CJUN抗體CELLSIGNALINGTECHNOLOGY1∶200過夜，次日，經(jīng)過熒光二抗孵育1小時，DAPI染核后，在激光共聚焦顯微鏡下，觀察目的蛋白的表達水平。10凝膠遷移實驗EMSA利用EMSA方法檢測16％牽張力對轉(zhuǎn)錄因子AP1與NFΚB活性的影響。牽張力干預平滑肌細胞結(jié)束后，利用PIERCE細胞核蛋白提取試劑盒收集細胞核蛋白，并利用BCA方法檢測核蛋白的濃度。使用T4連接酶在AP1與NFΚB雙鏈核苷酸探針末端標記Γ32PATP，取8UG核蛋白與標記的轉(zhuǎn)錄因子探針及試劑盒其它成分共計20UL預混后，冰上孵育30分鐘，然后用4％非變性膠進行電泳，根據(jù)PIERCEEMSA試劑盒說明書操作具體步驟。11統(tǒng)計學分析所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準誤表示，使用SPSS130統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，兩組之間的比較采用非配對T檢驗，多組之間的比較采單因素方差分析，P＜005認為有統(tǒng)計學意義。結(jié)果1機械牽張力對體外培養(yǎng)的人主動脈平滑肌細胞HASMCSMIR21表達水平的影響研究結(jié)果顯示，在無血清條件下，與靜止培養(yǎng)的細胞相比，16％牽張力自6小時開始顯著上調(diào)體外培養(yǎng)的HASMCSMIR21的表達水平，上調(diào)趨勢保持到24小時，表達高峰在12小時P＜001）而10％牽張力對HASMCSMIR21的表達水平?jīng)]有顯著影響P＞005）。在有血清刺激的條件下，16％牽張力仍然持續(xù)上調(diào)MIR21的表達P＜001，但上調(diào)幅度沒有無血清條件下明顯而10％牽張力明顯抑制MIR21的表達，與靜止對照相比，MIR21的表達6小時開始顯著下調(diào)P＜005，12小時下調(diào)最明顯。2MIR21在機械牽張力調(diào)控人主動脈平滑肌細胞增殖中的作用利用BRDU摻入法與細胞計數(shù)的方法檢測MIR21在牽張力調(diào)節(jié)的HASMCS增殖中的作用。實驗結(jié)果顯示，與靜止培養(yǎng)的細胞相比16％牽張力顯著增強HASMCS的增殖水平轉(zhuǎn)染MIR21抑制物INHIBIT抑制MIR21的水平，結(jié)果與MIRNA陰性對照INHIBIT相比，MIR21的表達水平下調(diào)42倍P＜001，而轉(zhuǎn)染MIR21INHIBIT的HASMCS增殖水平顯著下降P＜001。同樣的實驗條件下，利用胰酶消化的方法收集細胞后進行細胞計數(shù)，結(jié)果顯示與BRDU摻入法一致P＜005。由于在含血清條件下，10％牽張力抑制MIR21的表達，轉(zhuǎn)染化學修飾的MIR21類似物MIMICS上調(diào)MIR21的表達水平，結(jié)果顯示MIR21MIMICS升高MIR21的表達70倍P＜001）而BRDU摻入法結(jié)果顯示，與靜止培養(yǎng)的HASMCS相比，10％牽張力顯著抑制細胞的增殖水平P＜001，而轉(zhuǎn)染MIR21MIMICS顯著降低10％牽張力對HASMCS增殖的抑制作用P＜005。WESTERNBLOT結(jié)果顯示16％牽張力抑制細胞周期抑制因子P27的表達，促進PRB的表達P＜001而與轉(zhuǎn)染MIRNA陰性對照INHIBIT相比，MIR21INHIBIT部分逆轉(zhuǎn)16％牽張力對P27，PRB表達的影響P＜001）。3MIR21在機械牽張力介導的人主動脈平滑肌細胞凋亡中的作用利用ANNEXINFITC與PI雙染細胞凋亡試劑盒檢測牽張力對細胞凋亡的影響，結(jié)果顯示與靜止對照組比較，16％牽張力增加體外培養(yǎng)的HASMCS凋亡水平919±066VS133±012，P＜001轉(zhuǎn)染MIR21INHIBIT抑制MIR21的水平，結(jié)果顯示與陰性對照MIRNAINHIBIT相比較，MIR21INHIBIT顯著增強了16％牽張力對HASMCS的促凋亡作用255±161VS938±157，P＜001在靜止培養(yǎng)的HASMCS中，轉(zhuǎn)染MIR21INHIBIT對細胞凋亡沒有顯著的影響。在有血清條件下，對靜止對照組相比較，10％牽張力對HASMCS的凋亡沒有顯著影響P＞005。4PDCD4在16％牽張力介導的人主動脈平滑肌細胞凋亡中的作用利用TAKARACDNA合成與SYBRGREENPCR定量試劑盒檢測16％牽張力對HASMCSPDCDMRNA水平的影響，結(jié)果顯示與靜止對照組相比，16％牽張力增加PDCD的MRNA水平198倍P＜005，而WESTERNBLOT結(jié)果顯示，16％牽張力顯著抑制PDCD的蛋白水平055倍P＜005）。轉(zhuǎn)染MIR21INHIBIT后，16％牽張力對HASMCSPDCD4蛋白水平的抑制作用明顯減輕P＜005。為明確PDCD4在牽張力誘導的HASMCS凋亡中的作用，轉(zhuǎn)染PDCD4表達質(zhì)粒上調(diào)其蛋白表達水平，再給予16％牽張力刺激，細胞流式結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染PDCD4表達質(zhì)粒明顯促進16％牽張力的誘導細胞凋亡作用P＜001）。516％牽張力對人主動脈平滑肌細胞AP1、NFΚB活性的影響利用實時熒光定量PCR的方法檢測16％牽張力對HASMCSMIR21轉(zhuǎn)錄初級產(chǎn)物PRIMIR21，前體PREMIR21水平的影響，結(jié)果顯示對靜止對照相比，16％牽張力分別增加PRIMIR21水平173倍P＜005，PREMIR21水平285倍P＜001。AP1、NFΚB是介導機械牽張力調(diào)控平滑肌細胞生物學功能的重要轉(zhuǎn)錄因子，在特定條件下也參與MIR21的表達調(diào)控。WESTERNBLOT結(jié)果顯示，16％牽張力明顯增加NFΚBP65的磷酸化水平，高峰在牽張力干預后1、3小時，至6小時恢復至靜止對照水平，而16％牽張力對NFΚBP65的蛋白水平?jīng)]有顯著影響16％牽張力持續(xù)引起CJUN的表達水平和磷酸化水平顯著增高，但對CFOS蛋白的表達水平及磷酸化水平?jīng)]有明顯影響。細胞免疫熒光結(jié)果顯示，16％牽張力增加CJUN在細胞核中的表達，而增加CFOS在胞漿中的表達，CFOS在胞核中的表達沒有顯著變化。EMSA結(jié)果顯示，16％牽張力顯著增加HASMCSAP1與NFΚB的活性P＜005。6AP1、NFΚB在16％牽張力誘導HASMCSMIR21表達中的作用利用LIPO2000轉(zhuǎn)染CJUNSIRNA下調(diào)HASMCSCJUN的表達，16％牽張力干預HASMCS前1小時，加入NFΚB抑制劑SN50抑制其活性P＜001。結(jié)果顯示，CJUNSIRNA明顯抑制HASMCS中CJUN的表達，16％牽張力誘導的AP1活性顯著下降P＜001。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，CJUNSIRNA抑制16％牽張力誘導的MIR21表達P＜001，而SN50對16％牽張力誘導的MIR21表達沒有明顯作用P＞005。結(jié)論116％機械牽張力上調(diào)人主動脈平滑肌細胞MIR21的表達，而在有血清條件下，10％牽張力抑制MIR21的表達水平。2MIR21參與介導機械牽張力調(diào)節(jié)人主動脈平滑肌細胞增殖與凋亡的作用。3機械牽張力通過增強轉(zhuǎn)錄因子AP1CJUN的活性上調(diào)人主動脈平滑肌細胞MIR21表達。

簡介：目的研究結(jié)締組織生長因子CONNECTIVETISSUEGROWTHFACTCTGF對增生性瘢痕成纖維細胞HYPERTROPHICSCARFIBROBLASTHSF生物學功能的影響探討CTGF獨立致組織纖維化的作用機理并初步確定絲裂原活化蛋白激酶MITOGENACTIVATEDPROTEINKINASEMAPK各亞家族作為其下游信號轉(zhuǎn)導通路的活化效應為增生性瘢痕發(fā)病機制研究及防治措施提供新的思路方法1、分離培養(yǎng)人HSF以正常人皮膚成纖維細胞NMALSKINFIBROBLASTNSF作為對照采用不同濃度CTGF作用細胞或以同一濃度CTGF作用細胞不同時間后MTT法檢測細胞增殖H3脯氨酸摻入法檢測細胞膠原合成率RTPCR檢測細胞Ⅰ型前膠原、CTGFMRNA的表達。2、應用WESTERNBLOT蛋白免疫印跡法檢測CTGF刺激細胞后不同時相點MAPK途徑亞家族ERK12、P38、JNK磷酸化蛋白表達的動態(tài)變化情況篩選CTGF作用于HSF活化的下游MAPK信號分子。3、預先用ERK12特異性抑制劑PD98059及P38特異性抑制劑SB203580阻斷細胞信號再加入CTGF刺激MTT法及H3胸腺嘧啶摻入法H3TDR檢測細胞增殖H3脯氨酸摻入法檢測細胞膠原合成RTPCR檢測細胞Ⅰ型前膠原、CTGFMRNA、ΑSMAMRNA的表達流式細胞術(shù)檢測ΑSMA陽性細胞率WESTERNBLOT技術(shù)檢測ΑSMA蛋白表達變化確定CTGF活化MAPK亞家族P38、ERK12的信號轉(zhuǎn)導途徑及對細胞生物學功能的影響過程。結(jié)果1、MTT檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)HSF在CTGF的獨立刺激作用下增殖明顯在一定濃度范圍5NGML～20NGML及時間0～48H呈明顯的濃度依賴性和時間依賴性CTGF對HSF的促增殖作用強于NSF。2、H3脯氨酸摻入法檢測細胞膠原合成變化發(fā)現(xiàn)小劑量CTGF5NGML即能顯著增加HSF的膠原合成且隨CTGF濃度的升高及作用時間的延長而增強CTGF也能增加NSF膠原合成水平但增加幅度較低。RTPCR法檢測HSF與NSF細胞Ⅰ型前膠原MRNA表達變化趨勢的結(jié)果類似。3、RTPCR法檢測在外源性CTGF刺激下HSF細胞內(nèi)CTGFMRNA的表達變化發(fā)現(xiàn)在50NGMLCTGF的刺激作用下HSF中CTGFMRNA于刺激開始后8H表達顯著升高且一直保持升高趨勢于48H后表達水平達到峰值并至少維持至72H與空白對照組比有顯著性差異P＜005NSF中CTGFMRNA的表達在外源性CTGF刺激作用下也有小幅度增高。4、WESTERNBLOT法檢測CTGF作用后HSF中MAPK信號的活化情況發(fā)現(xiàn)磷酸化ERK12的表達自刺激作用開始后10MIN即顯著升高30MIN時活化達到最高峰此后逐漸下降240MIN時恢復至刺激前水平磷酸化P38表達自CTGF作用后30MIN增高120MIN時達到最高峰此后逐漸下降240MIN時恢復至刺激前水平磷酸化JNK表達水平在CTGF刺激作用下240MIN內(nèi)均無顯著變化。5、采用PD98059特異性阻斷HSF中ERK12信號通路再用CTGF進行刺激結(jié)果提示與未用PD98059阻斷組相比細胞增殖率及DNA合成率均顯著受抑但仍高于無CTGF刺激組P＜005ΑSMA的MRNA及蛋白表達與ΑSMA陽性細胞率、膠原合成及CTGFMRNA表達等在阻斷前后無顯著性變化。6、采用SB203580特異性阻斷HSF中P38信號通路再加入CTGF進行刺激結(jié)果顯示ΑSMAMRNA及蛋白表達、ΑSMA陽性細胞率等細胞轉(zhuǎn)分化指標與未阻斷組相比顯著受抑但仍高于無CTGF刺激組P＜005細胞增殖及DNA合成、膠原合成率、Ⅰ型前膠原MRNA、CTGFMRNA的表達均未受到抑制。結(jié)論1、CTGF能獨立有效地促進HSF增殖、轉(zhuǎn)分化及膠原合成其促增殖作用具有顯著的濃度依賴性和時間依賴性。2、CTGF具有對HSF細胞促進自身CTGFMRNA自分泌表達的效應。3、CTGF主要通過激活MAPK通路中ERK12及P38亞家族信號途徑發(fā)揮生物學效應其中對ERK12信號途徑的活化部分介導CTGF刺激HSF細胞增殖效應對P38信號途徑的活化部分介導CTGF誘導細胞轉(zhuǎn)分化效應。

簡介：分類號分類號R7337學校代號學校代號10392學科專業(yè)代碼學科專業(yè)代碼100208學號號200901517福建醫(yī)科大學碩士研究生畢業(yè)論文慢病毒介導慢病毒介導WWOX基因過表達基因過表達對JURKAT及K562白血病細胞白血病細胞生物學特性影響生物學特性影響的實驗研究的實驗研究EFFECTSOFLENTIVIRUSMEDIATEDWWOXGENEOVEREXPRESSIONONBIOLOGICALPROPERTIESOFJURKATK562HUMANHEMATOPOIETICMALIGNANTCELLS學位類型型醫(yī)學碩士醫(yī)學碩士所在學院院醫(yī)學技術(shù)與工程學院醫(yī)學技術(shù)與工程學院研究生崔兆磊崔兆磊學科、?？?、專業(yè)臨床檢驗診斷學臨床檢驗診斷學導師林東紅林東紅教授教授胡建達胡建達教授教授研究起止日期研究起止日期2010年9月至月至2012年2月答辯日期2012年5月31日二〇一二年二〇一二年六月目錄中文摘要1英文摘要3前言6第一部分WWOX基因過表達慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定8材料與方法8實驗結(jié)果16討論21結(jié)論22第二部分慢病毒介導的WWOX過表達對JURKAT及K562白血病細胞生物學特性的影響23材料與方法23實驗結(jié)果29討論43結(jié)論46第三部分WWOX基因過表達誘導JURKAT及K562細胞凋亡的分子機制研究47材料與方法47實驗結(jié)果53討論60結(jié)論63參考文獻64綜述69致謝78